不同有機酸協(xié)同超高壓處理對黃酒中醇水締合影響的研究

曹晶晶,曾慶梅,*,張傲娜,嚴(yán)王慧,鄭 玥,魏國華

(1.合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,安徽合肥 230009;2.合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥 230009)

黃酒營養(yǎng)豐富,有“液體蛋糕”之稱,是具有特殊風(fēng)味和口感的醇水溶液。它作為傳統(tǒng)的酒精發(fā)酵飲料,是中國最受歡迎的酒精飲料之一,年消耗量達(dá)數(shù)百萬升[1]。對于自然老熟過程,人們提出了“締合說”[2]。締合說認(rèn)為,新酒中游離的酒精分子或酒精分子團(tuán)較多,對感官的刺激性較大,口感欠佳;水和乙醇都是極性分子,有很強的締合能力,在貯存過程中,黃酒中的乙醇分子與水分子之間通過氫鍵發(fā)生締合作用,使更多的乙醇分子受到束縛,游離的乙醇分子數(shù)目減少,從而降低了酒精對味覺器官的刺激作用,飲酒感到柔和、圓潤、刺激性小;黃酒中水和乙醇含量約占整體的95%[3]。根據(jù)締合說,黃酒中主要存在水-水,水-乙醇和乙醇-乙醇分子間的氫鍵締合作用。研究[4]表明黃酒刺激性降低被認(rèn)為是水-乙醇分子的氫鍵結(jié)構(gòu)的變化。

新生黃酒在陶壇中貯存至少一年才能上市。傳統(tǒng)的陳化過程耗時耗力,生產(chǎn)周期長,影響企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益[2]。目前超高壓(Ultra-High Pressure,UHP)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于酒類研究中[5],高壓能夠為酯化、氧化等化學(xué)反應(yīng)提供能量,加快老熟[6],并且不會對酒體的顏色、pH、濁度等感官性質(zhì)產(chǎn)生有害作用。但關(guān)于超高壓在黃酒氫鍵締合的應(yīng)用報道較少;黃酒中的有機酸種類較為豐富。適量的酸在酒中起到緩沖、調(diào)和、諧味的作用[7]。有機酸中的羥基質(zhì)子極性較強,可能對黃酒的氫鍵締合具有一定影響[8-9]。

在溶液化學(xué)領(lǐng)域,醇水溶液的氫鍵研究是最具吸引的課題之一。而飲料酒中的氫鍵研究卻相對較少。喬華[2]等人基于粘度考察了酒度、貯存時間及汾酒中主要微量成分對模型白酒黏度的影響。楊星[10]等對通過核磁共振研究白酒模擬體系發(fā)現(xiàn),隨著貯藏時間的延長,體系中氫鍵締合強度逐漸增強。目前,大多數(shù)學(xué)者僅用1H-NMR光譜中水的羥基質(zhì)子峰來表征氫鍵締合強度[11]。本文在同時考察水和乙醇羥基質(zhì)子峰基礎(chǔ)上,還進(jìn)行了粘度測量。通過有機酸協(xié)同超高壓處理新生黃酒來強化氫鍵締合,以期找到一種有效的方法解決新生黃酒刺激性大的問題,以指導(dǎo)生產(chǎn)實踐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

二次超純水;99.7%乙醇、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、丙酮酸等均為分析純,所有試劑 均購自合肥美豐化學(xué)儀器有限公司；新壓榨未經(jīng)陳釀的新生黃酒、一年陳黃酒 取自安徽省古南豐酒業(yè)有限公司。

1 L YcB630/2.5超高壓設(shè)備(工作壓力0～600 MPa,工作溫度0～80 ℃) 兵器工業(yè)第五二研究所;DZQ-400多功能真空包裝機 上海嘉歆包裝機械有限公司;烏式粘度計(0.6～0.7 mm) 上海前鋒橡塑玻璃制品廠生產(chǎn);粘度計專用恒溫水浴槽 上海平軒科學(xué)儀器有限公司;超導(dǎo)核磁共振(NMR)光譜儀 美國安捷侖公司;sanorious PB-10 pH計 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;氣質(zhì)聯(lián)用儀 德國布魯克公司。

1.2 實驗方法

1.2.11H-NMR檢測1H-NMR用超導(dǎo)核磁共振光譜儀在20 ℃、400 MHz下操作。氘代試劑是由美國CIL生產(chǎn)的含有0.03%(體積分?jǐn)?shù))(TMS)作為外部參比的CO(CD3)2。

1.2.2 粘度檢測 通過烏式粘度計測量粘度。毛細(xì)管直徑為0.6～0.7 mm。通過循環(huán)恒溫水浴槽將測試溫度保持在(30±0.05) ℃。

1.2.3 黃酒氫鍵締合強度指標(biāo)的確定 用二次超純水將無水乙醇稀釋成乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為:0.00%、5.00%、10.00%、18.00%、30.00%、40.00%、50.00%、60.00%、70.00%、80.00%、90.00%、100.00%的溶液。按1.2.1和1.2.2方法測定上述溶液的1H-NMR和粘度。結(jié)合研究結(jié)果根據(jù)黃酒酒度范圍確定適用于黃酒體系的氫鍵締合強度檢測指標(biāo)。

1.2.4 樣品超高壓處理 將未經(jīng)陳釀的新生黃酒以及一年陳黃酒于3000 r/min下離心30 min,取上清液待用。取50 mL不同濃度的乙醇-水溶液分裝于聚乙烯袋中封口,排盡袋中空氣,并用封口機熱封口。確定超高壓的壓力條件為100、200、300、400 MPa,保壓時間20 min,對應(yīng)樣品編號為W100,20 min、W200,20 min、W300,20 min、W400,20 min;超高壓處理時間為5、10、20、30 min,壓力為300 MPa,對應(yīng)樣品編號為W300,5 min、W300,10min、W300,20 min、W300,30 min;未處理樣品編號為W0;溫度均為室溫,循環(huán)次數(shù)為一次。超高壓設(shè)備的有效體積為1 L,升壓速度100 MPa/min,降壓時間為5～10 s,腔內(nèi)水溫為常溫。

1.2.5 黃酒中有機酸對乙醇水氫鍵締合的影響 配制檸檬酸濃度為1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1 mol/L的18%(v/v)的乙醇水溶液,按1.2.1、1.2.2方法進(jìn)行1H-NMR和粘度檢測。蘋果酸、乳酸、乙酸、丙酮酸對18%乙醇水溶液氫鍵締合影響的考察方法同檸檬酸。

1.2.6 黃酒理化指標(biāo)及風(fēng)味物質(zhì)檢測 參照國標(biāo)《GB/T 13662-2008》的方法,對黃酒中酒精度、總糖、總酸、pH、氨基酸態(tài)氮、非糖固形物進(jìn)行測定。黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測沿用課題組已建立的頂空固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜法。內(nèi)標(biāo)物選擇2-乙基丁酸,具體的樣品預(yù)處理方法、頂空固定微萃取條件及色譜條件參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]。

1.2.7 黃酒感官評價 根據(jù)國標(biāo)《GB/T 13662-2008》的感官評價方法,擬定了已驗證過的黃酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)。由經(jīng)過訓(xùn)練的小組成員(每次8人)對黃酒樣品進(jìn)行色澤、香氣、口味以及風(fēng)格根據(jù)黃酒感官實驗評分表進(jìn)行感官品評,取平均分為最終得分。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均為三次實驗平均值,且粘度測量誤差在30 s以內(nèi)。核磁數(shù)據(jù)采用Mestre Nova軟件處理,實驗數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS 20.0和Origin 8.0進(jìn)行分析,p<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒氫鍵締合強度檢測指標(biāo)的確定

1H-NMR可以測量質(zhì)子的相對化學(xué)位移來確定氫鍵締合的類型。更重要的是,它可以反映分子間氫鍵締合的細(xì)節(jié)[13]。通過1H-NMR研究在乙醇摩爾濃度范圍內(nèi)水和乙醇混合液的氫鍵締合的情況。0%、5%、18%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%(v/v)和沒有H+或OH-雜質(zhì)的純乙醇溶液1H-NMR光譜如圖1所示。在整個乙醇濃度范圍內(nèi)的羥基質(zhì)子化學(xué)位移值如表1所示。

圖1 乙醇-水溶液的1H-NMR光譜

表1 隨著乙醇濃度變化乙醇和水羥基質(zhì)子化學(xué)位移值

由圖1可見,乙醇的羥基質(zhì)子峰隨著乙醇濃度的增加逐漸明顯;甲基和亞甲基隨乙醇濃度增加峰型無明顯變化;在乙醇摩爾分?jǐn)?shù)χ范圍內(nèi),水羥基質(zhì)子峰和醇羥基質(zhì)子峰獨立分離,易于區(qū)分。由表1看出在純水溶液中,只有水羥基質(zhì)子峰,羥基質(zhì)子化學(xué)位移δ(H-OH)為4.685。另一方面,在純乙醇溶液中,乙醇的羥基質(zhì)子化學(xué)位移δ(Et-OH)為4.994。根據(jù)黃酒國家標(biāo)準(zhǔn)[14],在黃酒的酒度范圍內(nèi),1H-NMR顯示易于區(qū)分的乙醇和水的羥基質(zhì)子峰。

圖2(a)顯示,在EtOH-H2O溶液中,甲基和亞甲基的質(zhì)子化學(xué)位移在很大程度上不受乙醇濃度的影響。因此,它們可作為內(nèi)部參考峰。圖2(b)可以看出,在0<χ(乙醇摩爾濃度)<1.00范圍內(nèi),乙醇羥基質(zhì)子化學(xué)位移遠(yuǎn)高于純乙醇δ(Et-OH)=4.994(χ=1),水質(zhì)子化學(xué)位移比純水的δ(H-OH)=4.685(χ=0)小得多。據(jù)了解,氫鍵締合影響醇水結(jié)構(gòu)。隨著質(zhì)子外部環(huán)境的變化,其化學(xué)位移發(fā)生變化,原來的乙醇-乙醇和水-水結(jié)構(gòu)被破壞。在不同的乙醇摩爾濃度區(qū)域微觀締合結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)新的狀態(tài)。這個結(jié)論與Burikov[14]等人通過分析拉曼和紅外光譜研究了乙醇-水體系的結(jié)論一致。

圖2 乙醇水溶液的1H-NMR數(shù)據(jù)及體系粘度變化

Dixit[16]認(rèn)為乙醇和水混合后的熱力學(xué)變化是由于系統(tǒng)內(nèi)分子之間氫鍵的不完全混合造成的。因此為了確定氫鍵強度,我們在不同乙醇濃度的乙醇-水溶液中讀取了兩個羥基質(zhì)子峰。

δ(χ)為溶液中乙醇和水的羥基質(zhì)子化學(xué)位移加權(quán)平均值:

δ(χ)=δe(χ)χ+δw(χ)(1-χ)

式(1)

式(1):δe(χ)和δw(χ)分別表示乙醇摩爾分?jǐn)?shù)為χ時,乙醇和水的羥基質(zhì)子化學(xué)位移。

假設(shè)溶液混合的理想狀態(tài)是指兩者在混合體系內(nèi)不發(fā)生任何締合作用,δ°(χ)為理想混合時純水和純乙醇的羥基質(zhì)子加權(quán)平均化學(xué)位移:

δ°(χ)=δe(0)χ+δw(1)(1-χ)

式(2)

式(2):δe(0)和δw(1)分別為純乙醇和純水未經(jīng)超高壓處理的羥基質(zhì)子化學(xué)位移。

為了更直觀的說明乙醇-水溶液的不完全混合與理想混合之間的差別,又引入公式:

Δδ=δ°(χ)-δ(χ)

式(3)

其中Δδ越大,表明乙醇和水分子混合狀態(tài)與理想混合相差越遠(yuǎn),分子間氫鍵締合越強。

圖2(c)顯示了δ°(χ),δ(χ)隨乙醇摩爾分?jǐn)?shù)增加的變化情況。當(dāng)乙醇摩爾濃度χ為0.550時,Δδ值達(dá)到最大值,結(jié)果與粘度測量一致(參見圖2(d))。原因可能是此時乙醇與水分子之間形成穩(wěn)定的氫鍵結(jié)構(gòu)。乙醇-水溶液中乙醇與水的摩爾比接近1∶2,導(dǎo)致在強氫鍵下形成穩(wěn)定的環(huán)狀三聚體締合結(jié)構(gòu)[17]。

2.2 超高壓處理對乙醇-水體系中醇水締合影響

2.2.1 超高壓處理壓力對乙醇-水體系中醇水締合影響 按1.2.4的方法對樣品進(jìn)行超高壓處理,不同壓力處理20 min下乙醇-水體系的Δδ變化見表2。

表2 不同壓力處理20 min對醇水體系氫鍵締合影響

由表2可見,隨著處理壓力的增大,醇水體系的Δδ值先增大后減小,并且在300 MPa下,達(dá)到最大值。這可能是由于高壓對醇水溶液提供的能量,促進(jìn)乙醇水體系形成更為穩(wěn)定的氫鍵締合群。而隨著壓力增加到一定值時,過多的能量破壞溶液中原有的水分子和乙醇分子之間的締合群,溶液中游離態(tài)乙醇分子、水分子增加,使氫鍵締合向著減弱的方向移動[18]。可見壓力過大反而能破壞原有的醇水氫鍵締合。

2.2.2 超高壓處理時間對乙醇-水體系中醇水締合影響 按1.2.4的方法對樣品進(jìn)行超高壓處理,300 MPa不同處理時間下乙醇-水體系的Δδ變化見表3。

由表3可見,隨著處理時間的增加,醇水體系的Δδ值先增大后減小,并且在20 min處理下,達(dá)到最大值。這可能是由于隨著處理時間的增加,高壓物理能的積聚與壓力不斷增大所產(chǎn)生的物理能的效果相同導(dǎo)致,并且在20 min處理條件下,更有利于促進(jìn)體系的乙醇-水分子間的氫鍵締合。

表3 300 MPa不同處理時間對醇水體系氫鍵締合影響

分別對壓力和時間兩個因素進(jìn)行單因素方差分析,可得壓力對醇水氫鍵締合的影響更顯著。綜合上述數(shù)據(jù)分析可得在300 MPa、20 min處理條件下,醇水體系中的乙醇分子與水分子之間的締合得到了較大加強,為解釋超高壓處理能夠加速酒體的陳釀過程提供了一定的實驗依據(jù)。

2.3 有機酸對醇水氫鍵締合的影響

2.3.1 檸檬酸對醇水氫鍵締合的影響 在乙醇水溶液中,考察了不同濃度檸檬酸對-OH質(zhì)子化學(xué)位移的影響(參見圖3)。在檸檬酸濃度1×10-3mol/L時可引起黃酒化學(xué)轉(zhuǎn)移向低場移動(參見圖3(b))。如圖3(c)可見,即使添加1×10-4mol/L的檸檬酸,也可以清楚地觀察到可易于區(qū)分的水和乙醇的羥基質(zhì)子峰。但圖3(a)中當(dāng)檸檬酸濃度為1×10-1mol/L中乙醇和水的兩個-OH峰合并為單峰并位于較低場(δ=5.11)。有學(xué)者提出,由于快速的質(zhì)子交換,醇水間氫鍵締合作用加強,乙醇和水的羥基質(zhì)子峰合并為單峰。因此,圖4所示合并單峰的羥基質(zhì)子化學(xué)位移δ值隨著檸檬酸濃度的增加而增加,即氫鍵締合強度不斷增強。

圖3 乙醇-水溶液在不同濃度檸檬酸添加下的1H-NMR光譜

圖4 -OH質(zhì)子化學(xué)位移隨檸檬酸濃度的變化

圖5 有機酸對醇水氫鍵締合的影響

圖6 各種有機酸的分子鍵線式

Fig.6 The molecular structure of various organic acids

圖7 一維核磁共振氫譜

Fig.7 The proton spectra after different treatment

注:a.原酒;b.超高壓處理酒;c.蘋果酸-超高壓處理酒;d.檸檬酸-超高壓處理酒;e.一年陳黃酒。

2.3.2 其他酸對醇水氫鍵締合的影響 本文還研究了蘋果酸、丙酮酸、乙酸和乳酸對模型黃酒醇水氫鍵締合的影響(參見圖5)。結(jié)果表明所研究的酸均會導(dǎo)致Δδ和粘度值隨著乙醇濃度的增加而增加。酸引起了H2O和EtOH分子之間的緊密關(guān)聯(lián)。酸對氫鍵的影響可分為兩個因素:未解離的酸分子(HA)和解離的H+[19]。由圖5可見,有機酸對模型黃酒氫鍵締合強度影響順序為:蘋果酸,乳酸,丙酮酸,乙酸。酸對氫鍵締合的影響可能與-OH,-COOH和-C=O基團(tuán)的數(shù)量有關(guān)。圖6可知,乳酸具有一個羧基(-COOH)和一個羥基(-OH),而蘋果酸具有兩個羧基,且它們碳骨架一致。通過比較1.0 mol/L蘋果酸與同濃度下乳酸的Δδ值,得出基于羧基對Δδ的貢獻(xiàn)值約為0.123。黃酒中的有機酸除了含有羥基外,還有吸電子基團(tuán)—羰基,這就使得羥基上的氫(通常稱羥基氫)正電性更強[7]。因此酸氫鍵作用力比醇更強。其不僅與乙醇水的締合群形成分子間氫鍵,還可能直接參與乙醇水的締合結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò),形成了新的酸-醇-水締合結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)。

2.4 有機酸協(xié)同超高壓處理對黃酒氫鍵締合的影響

根據(jù)上述實驗結(jié)果可以設(shè)想:令有機酸與超高壓協(xié)同作用處理新生黃酒,對處理后黃酒進(jìn)行氫鍵締合強度檢測。擬找到強化黃酒氫鍵締合的工藝措施,改善陳釀周期長等缺點[20]。分別取100 mL黃酒共4組,第一組為空白對照組,第二組未加有機酸,第三組和第四組分別加入10-3mol/L的檸檬酸,蘋果酸。然后第二、三、四組再進(jìn)行300 MPa,20 min超高壓處理。并分別對這四組黃酒和一年陳黃酒進(jìn)行1H-NMR檢測,見圖7。由于黃酒成分復(fù)雜,所含微量成分整體效果是促進(jìn)醇水間羥基質(zhì)子的快速交換,使得黃酒的核磁氫譜圖只存在一個合并單峰。此單峰可以較好的反映黃酒的氫鍵締合強度,此結(jié)果與2.3.1研究一致。由圖7可見,空白對照組新酒中合并單峰的羥基質(zhì)子位移δ為4.436。超高壓處理組δ為4.468。蘋果酸協(xié)同超高壓組和檸檬酸協(xié)同超高壓組δ值分別移動到4.474和4.502,而一年陳黃酒δ為4.477。超高壓處理組和有機酸協(xié)同超高壓組δ均向低場移動。檸檬酸協(xié)同超高壓處理新生黃酒氫鍵締合強度優(yōu)于一年陳黃酒。由此可以認(rèn)為檸檬酸協(xié)同超高壓處理新生黃酒能夠增強黃酒氫鍵締合,改善新酒刺激辛辣味,使口感更為圓潤柔和。

2.5 有機酸協(xié)同超高壓處理對黃酒主要理化性質(zhì)及風(fēng)味成分的影響

由表4可見,處理酒相比較于原酒,其酒精度、總酸、pH均呈現(xiàn)一定程度的降低。總酸降低可能是添加少量有機酸有利于酯化反應(yīng)向正方向進(jìn)行,且與超高壓的綜合作用結(jié)果使總酸降低。酒精度的變化可能是有機酸協(xié)同超高壓處理加強了游離乙醇分子與水的締合作用,使更多的游離乙醇分子受到束縛。處理后的黃酒符合國標(biāo)《GB/T 13662-2008》中相關(guān)指標(biāo)的規(guī)定。由表5可見,經(jīng)處理后的新生黃酒,其醇類、醛類風(fēng)味物質(zhì)均有一定程度的降低,而揮發(fā)性酯類物質(zhì)含量增加。原因可能是有機酸協(xié)同超高壓條件下,促進(jìn)了酯化反應(yīng)向正方向移動。處理酒的醇類和醛類降低,使新酒的醇醛辛辣刺激感降低。經(jīng)檸檬酸協(xié)同超高壓處理的新生黃酒其醇、醛、酸、酯類風(fēng)味成分的總量均接近于一年陳水平。

表4 不同條件處理對黃酒主要理化指標(biāo)的影響

表5 不同條件處理對黃酒風(fēng)味成分的影響

2.6 有機酸協(xié)同超高壓處理對黃酒感官品評的影響

由表6可見,有機酸協(xié)同超高壓處理新生黃酒,透明度增加,澀度、刺激度均一定程度的降低,口感更加柔和,酒體更加協(xié)同,且無異味產(chǎn)生。檸檬酸協(xié)同超高壓處理新生黃酒,感官品評得分略高于一年陳黃酒,這也與氫鍵締合、GC-MS分析結(jié)果相符。

3 結(jié)論

通過對0～1.0 mol/L乙醇濃度的乙醇水溶液的1H-NMR及粘度檢測,確定了適用于黃酒酒度范圍的醇水氫鍵締合強度指標(biāo):Δδ、η。相關(guān)實驗表明,Δδ和η越大,氫鍵締合強度越強。超高壓處理乙醇水體系,改變了體系的氫鍵締合強度。300 MPa,20 min超高壓處理下,乙醇水氫鍵締合增強最明顯,但壓力過大反而會破壞體系氫鍵。大多數(shù)的酸能促進(jìn)醇水氫鍵締合強度,并且基于羧基(-COOH)對Δδ貢獻(xiàn)值約為0.123。當(dāng)檸檬酸添加量為1×10-3mol/L時,由于體系快速的質(zhì)子交換,一維核磁氫譜圖僅出現(xiàn)乙醇和水的羥基質(zhì)子合并單峰,此單峰較好地反映體系的醇水氫鍵締合強度。氫鍵締合越強,單峰越向低場移動。檸檬酸協(xié)同超高壓處理黃酒氫鍵締合強度略高于一年陳黃酒,且其口感和風(fēng)味均得到改善。由此認(rèn)為,檸檬酸協(xié)同超高壓處理,可有效促進(jìn)黃酒中醇水氫鍵締合,降低新酒刺激味。