高壓熱殺菌處理對枯草桿菌芽孢皮層裂解酶活力的影響

章 中,孫 靜,張津瑜,郭洪偉,賀曉光

(寧夏大學農學院,寧夏銀川 750021)

芽孢是細菌營養體在缺乏營養的環境條件下形成的休眠態,對輻照、超高壓、熱、超聲波、微波、化學物質等各種殺菌處理有極強的抗性[1-4]。高壓熱殺菌處理(HPTS)將超高壓和溫度耦合起來殺菌,對細菌芽孢有良好的殺滅作用,且對食品品質影響較小[5-6]。Uchida等[7]報道HPTS(600 MPa、65 ℃)能殺滅酸土脂環酸芽孢桿菌芽孢。Ates等[8]報道HPTS(650 MPa、65 ℃、10 min)能殺滅4.5個對數的枯草芽孢桿菌芽孢。Evelyn等[9]報道:HPTS(400～600 MPa、70 ℃)能殺滅牛奶中的蠟樣芽孢桿菌芽孢,Weibull模型能很好地描述芽孢死亡動力學。Luu-Thi等[10]報道HPTS(300～600 MPa、60～100 ℃)能殺滅蠟樣芽孢桿菌芽孢,HPTS處理下初期芽孢死亡較快、后期較慢,但兩個階段均可用一級動力學模型描述。HPTS對芽孢的殺滅作用和殺菌動力學已有廣泛報道,但關于HPTS殺滅芽孢的機理卻鮮有報道。芽孢的皮層是其耐壓特性的關鍵結構,皮層主要由肽聚糖構成,前期研究發現HPTS處理下細菌芽孢皮層肽聚糖發生了水解[1],這是導致芽孢死亡的重要原因之一,然而其水解機理尚不明確,存在兩種僅有的可能性:其一是HPTS能激活芽孢自身的皮層裂解酶,其二是HPTS未能激活皮層裂解酶,而其是芽孢中唯一能特異性地水解皮層肽聚糖的酶[1],即HPTS能導致皮層肽聚糖的非酶水解。

在休眠的芽孢中,皮層裂解酶不表現出活性,但在芽孢萌發而轉變成營養體的過程中,皮層裂解酶通過某種機制被激活并將皮層肽聚糖水解,這是芽孢萌發過程中的一個重要步驟[11]。Reineke等[12]認為HPTS可能會影響皮層裂解酶的活性,在一定壓力和溫度條件下,皮層裂解酶可能會被激活,導致芽孢皮層水解,進而使得芽孢結構被破壞。Mathys等[13]認為,HPTS處理下芽孢內部的2、6-吡啶二羧酸(DPA)的釋放可能會激活皮層裂解酶,從而將芽孢皮層水解,進而導致芽孢死亡。關于壓力和溫度對酶蛋白構象影響的報道很多[14-16],但未見有關溫度和壓力對芽孢皮層裂解酶活力影響的研究報道。

本實驗從枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的芽孢中提取皮層裂解酶,研究溫度、pH、磷酸鈉濃度、壓力和HPTS對芽孢皮層裂解酶活力的影響,以分析HPTS處理下芽孢皮層肽聚糖的水解機理,進一步闡明HPTS殺滅芽孢的機理,夯實HPTS技術在食品工業中應用的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌 中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC) 編號As 1.433;促芽孢生長錳鹽營養瓊脂培養基 向普通營養瓊脂培養基中加入MnSO4·H2O(使得培養基中Mn2+的濃度為50 mg/L),調pH至7,滅菌,備用;2,6-吡啶二羧酸(DPA) 分析純,美國Sigma公司;L-丙氨酸、肌苷 上海瑞永生物科技有限公司;其它化學試劑 均為分析純,天津市大茂化學試劑廠。

AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DSX-280B型高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;XMTD-6000型電子恒溫不銹鋼水浴鍋 上海宜昌儀器紗篩廠;LRH系列生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;GL-10C型冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;722型可見分光光度計 上海馳唐電子有限公司;FE28型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Agilent 1100型HPLC色譜儀及數據處理平臺 美國Agilent公司;Welch Ultimate AQ-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美國Welch公司;UV-2450型紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 枯草桿菌芽孢菌懸液的制備 芽孢的制備參照Gao[17]的方法。枯草芽孢桿菌用營養瓊脂培養基活化3代以上后,接入促芽孢生長培養基試管斜面上劃線培養,經37 ℃培養7 d后,用無菌去離子水將試管斜面上的芽孢洗滌收集到離心管里,然后用冷的無菌去離子水離心洗滌芽孢三次,離心條件為7000×g、4 ℃、15 min,離心后將上清液和沉淀的上部一起倒掉,洗滌后的芽孢重懸在無菌去離子水中,濃度約為1.5×109CFU/mL,放在4 ℃下保存,一個月內使用。

1.2.2 脫芽孢衣芽孢的制備 脫芽孢衣芽孢的制備參照Gombas[18]的方法。將枯草桿菌芽孢用30 mmol/L十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.2 mol/L 2-巰基乙醇、0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH=10.0)在40 ℃下處理8 h,再用蒸餾水徹底洗干凈。

1.2.3 芽孢萌發處理 萌發處理參照Miyata[19]和Makino[20]的方法。將枯草桿菌芽孢懸浮液(0.1 g/mL)在65 ℃下熱激活45 min,然后在冰水中冷卻,再經離心(7000×g、4 ℃、15 min)沉淀后,將芽孢置于10倍體積的、pH為7.0的、30 mmol/L的磷酸鈉緩沖液中,于32 ℃下萌發,磷酸鈉緩沖液中含有10 mmol/L的L-丙氨酸和4 mmol/L的肌苷。通過測定芽孢懸浮液OD600值的變化來判斷萌發的情況。

1.2.4 皮層裂解酶提取 皮層裂解酶提取參照Gombas[18]和Makino[20]的方法。在萌發處理后,將芽孢懸浮液離心(8000×g、4 ℃、10 min),取上清液(50 mL)在4 ℃透析處理2次,每次24 h,透析對照液為2 L、0.05 mol/L、pH=7.0的磷酸鈉緩沖液,緩沖液中含有1 mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)和1 mmol/L的巰基乙酸鈉。

1.2.5 皮層裂解酶活性分析 皮層裂解酶會導致脫芽孢衣芽孢萌發[19]。芽孢萌發時,其核心部分水化,導致其折光性發生變化,表現為脫芽孢衣芽孢懸浮液OD600值顯著下降,下降程度越高,芽孢的萌發率就越高,皮層裂解酶活性也就越高[21]。皮層裂解酶的活性分析參照Miyata[19]和Makino[20]的方法。在32 ℃下,通過測定1 cm光路內脫除芽孢衣的芽孢懸浮液的OD600值的減少量來評價酶的活性。反應混合物最終體積為5 mL,包含1 mL脫芽孢衣芽孢懸浮液和4 mL酶液,酶液包含0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH=7.0)、1 mmol/L的EDTA和1 mmol/L的巰基乙酸鈉。酶活性單位(U/L)定義為:每分鐘OD600值降低0.001所需的酶量。計算公式為:

式中:X為酶活(U/L),t為反應時間(min),V為參與反應的酶量(mL)。

1.2.6 RP-HPLC法檢測DPA DPA檢測參照Fichtel[22]的方法。使用C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫30 ℃,流動相是20%的甲醇和80%的磷酸氫鈉溶液(濃度為50 mmol/L,用磷酸調整pH至2.5),流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL，采用紫外檢測器檢測，檢測波長為272 nm。

1.2.7 各因素對皮層裂解酶活力的影響

1.2.7.1 溫度對皮層裂解酶活力的影響 取4 mL透析后的酶液,酶液包含0.05 mol/L、pH為7.0磷酸鈉緩沖液,分別于4、12、20、28、36、44、68 ℃培育20 min,對照組為4 mL無菌水在常溫下放置20 min,再向各組加入1 mL脫芽孢衣芽孢懸浮液,在32 ℃下反應,每10 min測一次OD600值,根據80 min內OD600值變化量計算酶活。

1.2.7.2 pH對皮層裂解酶活力的影響 分別調整酶液pH為4、5、6、7、8、9、10,酶液包含0.05 mol/L的磷酸鈉緩沖液,再各取4 mL酶液,對照組取4 mL無菌水,再向各組加入1 mL脫芽孢衣芽孢懸浮液,在32 ℃下反應,每10 min測一次OD600值,根據80 min內OD600值變化量計算酶活。

1.2.7.3 磷酸鈉濃度對皮層裂解酶活力的影響 將透析后酶液中的磷酸鈉濃度分別調整為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mol/L,酶液pH為7,再取4 mL酶液,對照組為4 mL無菌水,再向各組加入1 mL脫芽孢衣芽孢懸浮液,在32 ℃下反應,每10 min測一次OD600值,根據80 min內OD600值變化量計算酶活。

1.2.7.4 壓力對皮層裂解酶活力的影響 將透析后的酶液(包含0.05 mol/L、pH=7.0磷酸鈉緩沖液)分別于常壓、150、200、250、300、350、400、450、530 MPa下處理15 min,取處理后的酶液4 mL,對照組為4 mL無菌水在常壓放置15 min,再向各組加入1 mL脫芽孢衣芽孢懸浮液,在32 ℃下反應,每10 min測一次OD600值,根據80 min內OD600值變化量計算酶活。

1.2.7.5 HPTS處理對皮層裂解酶活力的影響 將磷酸鈉濃度為0.05、0.35 mol/L的兩種透析后的酶液于530 MPa、68 ℃下處理15 min,取處理后的酶液4 mL,對照組為4 mL透析后的酶液和4 mL無菌水在常溫常壓下放置15 min,再向各組加入1 mL脫芽孢衣芽孢懸浮液,在32 ℃下反應,每10 min測一次OD600值,根據80 min內OD600值變化量計算酶活。

1.3 數據處理

所有實驗重復三次,實驗結果均以平均值±標準差表示。數據采用Origin 8.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 芽孢皮層裂解酶提取液中DPA測定

芽孢萌發滲出物中不但有皮層裂解酶,也有DPA,而DPA也會誘導芽孢萌發,從而干擾實驗結果,為此通過透析處理來去除皮層裂解酶提取液中的DPA。通過全波段掃描可以看出在272.5 nm處DPA有最大吸收峰,因此選取272 nm作為檢測波長。由圖1b～c可知,DPA的出峰時間為4.64 min,而透析后的皮層裂解酶提取物僅在2.37 min時出現了一個峰,說明透析處理已將酶液中的DPA完全去除。

圖1 芽孢皮層裂解酶提取液中DPA含量分析

2.2 溫度對皮層裂解酶活力的影響

由圖2可知,在4～44 ℃溫度范圍內時,芽孢懸浮液的OD600值與對照組相比，均顯著下降(p<0.05),說明皮層裂解酶仍具活力,但是在此溫度范圍內,皮層裂解酶活力的變化并沒有明顯規律。而當溫度升至68 ℃時,芽孢懸浮液OD600值與對照組基本沒有變化,說明皮層裂解酶基本失活。Makino等[20]研究發現,60 ℃處理2 min或者45 ℃處理10 min時,分離出的皮層裂解酶就已經完全失活。Ando等[23]研究發現,當處理溫度為45 ℃時皮層裂解酶活力最強,而當處理溫度為60 ℃時酶活顯著降低,處理時間為20 min時酶完全失活。這些研究報道與本實驗的結果有細微差異,這可能與菌種有關,菌種不同,皮層裂解酶的分子量、分子結構不同,對溫度的耐受程度也不同,但以上研究報道均表明,60 ℃以上的熱處理會造成皮層裂解酶失活。

圖2 溫度對皮層裂解酶活力的影響

2.3 pH對皮層裂解酶活力的影響

由圖3可知,皮層裂解酶對pH非常敏感,當pH為4～7時,隨著pH的增大,芽孢懸浮液OD600值與對照組相比，下降幅度逐漸增大,說明皮層裂解酶活力逐漸增強;而當pH為7～10時,隨著pH的增大,OD600值與對照組相比，下降幅度逐漸減小,說明皮層裂解酶活力逐漸降低。當pH為7時,OD600值的下降幅度最大,說明皮層裂解酶的活力最強。Miyata等[19]研究發現:當pH為7.2～8.4時,皮層裂解酶活力最佳,隨著pH的減小，皮層裂解酶活力逐漸降低，當pH為3.4時，皮層裂解酶活力最低,這一研究報道與本實驗結果基本一致。在研究其它因素對皮層裂解酶活力的影響時,將酶液的pH調整為7,以避免其對酶活的影響。

圖3 pH對皮層裂解酶活力的影響

2.4 磷酸鈉濃度對皮層裂解酶活力的影響

由2.3中的實驗結果可知,pH是影響酶活性的一個重要因素,為維持穩定的pH,選用磷酸鈉緩沖液,因此研究了磷酸鈉濃度對皮層裂解酶活性的影響。由圖4可知,隨著磷酸鈉濃度的增大,芽孢懸浮液OD600值與對照組相比，下降幅度變小,說明皮層裂解酶的活力逐漸降低。當磷酸鈉濃度為0.05 mol/L時,OD600值與對照組相比，下降幅度最大,說明皮層裂解酶最具活力。而當磷酸鈉濃度為0.35 mol/L時,皮層裂解酶活性最小。這可能是由于該酶的催化部位對離子濃度非常敏感,離子濃度對形成精確的三維結構位點起著重要作用[20],而高濃度鈉鹽形成的高滲透壓作用及離子間靜電作用破壞了某些酶結構,從而導致酶活性降低[24]。在研究其它因素對皮層裂解酶活力的影響時,將磷酸鈉濃度調整為0.05 mol/L,以避免其對酶活的影響。

圖4 磷酸鈉濃度對皮層裂解酶活力的影響

2.5 壓力對皮層裂解酶活力的影響

由圖5可知,隨時間增加，各處理壓力下,芽孢懸浮液OD600值呈不斷下降趨勢,處理壓力較低時，芽孢懸浮液OD600值與對照組相比下降速度較快,最終下降幅度較大。較常壓相比,150、200 MPa下皮層裂解酶活力有所增強,當壓力超過300 MPa時,皮層裂解酶活力逐漸降低,但仍無法滅活皮層裂解酶。有報道稱超高壓會改變酶的活力,郝夢甄等[25]研究發現在較低壓力范圍內,隨著壓力的升高,海參體壁粗酶的酶活逐漸升高,250 MPa處理時,酶活達到最高值。陳發慶等[26]研究超高壓對核桃多酚氧化酶和過氧化物酶的影響時發現,當壓力在200 MPa以下時,多酚氧化酶和過氧化物酶的活力隨著壓力升高而增大,但當壓力超過200 MPa時,兩種酶的活力隨壓力升高而逐漸減小。在超高壓處理下,不同酶的活力變化是不同的,這是由于酶的種類和分子結構等不同而造成的。

圖5 壓力對皮層裂解酶活力的影響

2.6 HPTS處理對皮層裂解酶活力的影響

由2.4中結果可知,0.05 mol/L磷酸鈉濃度對皮層裂解酶活力影響最小,為進一步排除磷酸鈉濃度對HPTS殺滅芽孢效果的影響,選用高純水制備芽孢懸浮液以模擬天然的HPTS殺菌環境,發現HPTS處理下0.05 mol/L磷酸鈉溶液(pH=7.0)中的芽孢死亡率和高純水中芽孢死亡率無顯著差異(p>0.05)。由圖6可知,經530 MPa、68 ℃處理15 min后,0.05 mol/L磷酸鈉溶液(pH=7.0)中的皮層裂解酶基本失活,表現為芽孢懸浮液OD600值基本無變化。有文獻報道[14]:隨壓力和溫度的變化,以壓力和溫度為橫、縱坐標,酶構象和活力的變化呈現出一個橢圓形區域,在這個橢圓形區域內酶有活力,而在這個橢圓形區域外酶失活。實驗結果表明,在530 MPa和68 ℃下,皮層裂解酶位于失活區域,HPTS處理不但沒有激活皮層裂解酶,反而使得皮層裂解酶失去了活性,由此可推測HPTS處理下,芽孢皮層肽聚糖的水解方式是非酶水解,這對揭示HPTS殺滅細菌芽孢的機理有重要意義。

圖6 HPTS處理對皮層裂解酶活力的影響

3 結論

本文研究了磷酸鈉濃度、pH、溫度和壓力對枯草桿菌芽孢皮層裂解酶活力的影響,在此基礎上研究了HPTS對該酶活力的影響。結果發現,皮層裂解酶的最適磷酸鈉濃度為0.05 mol/L,當磷酸鈉濃度為0.35 mol/L時,皮層裂解酶活力較低;最適pH為7,偏酸或偏堿性條件下,活力均有所降低;溫度升至68 ℃時皮層裂解酶基本失活;在150～530 MPa壓力范圍內,壓力對皮層裂解酶活性基本無影響,然而HPTS處理時(530 MPa、68 ℃、15 min),皮層裂解酶基本失活。HPTS處理下芽孢皮層肽聚糖水解機理僅有兩種可能性,其一是HPTS激活皮層裂解酶,其二是HPTS導致皮層肽聚糖的非酶水解。實驗結果表明,HPTS處理不但沒能激活皮層裂解酶,反而導致了該酶的失活,由此可推測HPTS處理下芽孢皮層肽聚糖的水解方式是非酶水解。本實驗推進了對HPTS殺滅芽孢機理的理解,有助于HPTS技術在食品工業中的應用。