普洱茶固態發酵中轉化咖啡堿為茶堿菌株的鑒定與應用

馬存強,王洪振,周斌星,*,王子浩,李肖宏,伍 揚

(1.信陽農林學院河南省豫南茶樹資源綜合開發重點實驗室,河南信陽 464000;2.云南農業大學龍潤普洱茶學院,云南昆明 650201;3.昆明大樸茶業有限公司,云南昆明 650224)

嘌呤堿是茶葉中主要的生物堿,主要包括咖啡堿(1,3,7-三甲基黃嘌呤)、可可堿(3,7-二甲基黃嘌呤)、茶堿(1,3-二甲基黃嘌呤)等。在一般茶葉和茶樹品種中,咖啡堿含量較高,為2%～5%;可可堿含量次之,為0.2%～0.4%;茶堿含量最少,僅為0.008%～0.2%[1]。三種嘌呤堿具有不同的保健功效和生理活性。咖啡堿和可可堿主要具有興奮中樞神經、降低膽固醇、強心、利尿等功效[2-4]。茶堿可松弛支氣管平滑肌,具有良好的平喘作用[5];對肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放組胺有抑制作用,具有良好的抗炎癥效果[6];在急性和慢性哮喘治療中有廣泛應用[6-8]。由于茶葉中茶堿含量極低,以及咖啡堿等其他嘌呤堿的存在造成茶堿提純困難,茶堿的獲得主要來源于化工合成和對咖啡堿合成料液的選擇性吸附與富集,存在著一定的安全隱患和潛在的健康威脅[9-10]。

黑茶是在中國特有的微生物主導下的后發酵茶類[11]。普洱茶(熟茶)作為黑茶的一種,是以云南大葉種曬青毛茶為原料,經微生物、酶、濕熱、氧化等綜合作用形成具有獨有品質特征的茶葉類型[12]。渥堆發酵(后發酵,固態發酵)是普洱茶品質形成的關鍵工序。在渥堆發酵過程中,咖啡堿呈現增加或減少的變化趨勢[13-16]。在以茶葉為基質的微生物單菌落發酵中,酵母菌(Saccharomycetessp.)和黑曲霉(Aspergillusniger)能小幅度降低咖啡堿含量[17-18]。在茶樹生理[19]與微生物次生代謝[20]中,茶堿是咖啡堿主要降解產物和限速步驟。因此,在普洱茶渥堆發酵過程中篩選產茶堿功能的目的菌株具有一定的可操作性和實用價值。

本文以咖啡堿為底物,分別以固態培養和液態培養等方式對普洱茶渥堆中產茶堿的菌株進行有效篩選,通過18SrDNA序列測定對目的菌株進行分子生物學鑒定,并分別以茶葉、茶湯為基質進行單菌落發酵,探究目的菌株轉化咖啡堿為茶堿的能力，以期為高茶堿茶葉的開發提供菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云南大葉種曬青毛茶 主要用于發酵,昆明大樸茶業有限公司;菌株共11株 分離自普洱茶渥堆茶樣中的優勢真菌,在實驗室-20 ℃下純甘油保存;咖啡堿、茶堿等色譜純標準品 純度≥99%,美國sigma公司;DNA Marker、PCR擴增引物、IST1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、IST4(5′-TCCTCCGCTTATTGATAGC-3′) 日本TaKaRa公司;咖啡堿 純度≥98%,分析純,培養基用,上海梯希愛化成工業發展有限公司。

Agilent 1200型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;BH-2 OLYMPUS光學顯微鏡 日本奧林巴斯公司;PCR擴增儀 美國Bio-Rad公司;ABI Prism 3730型DNA自動測序儀 美國ABI公司。

咖啡堿固態篩選培養基:瓊脂20 g、氯霉素0.1 g、蒸餾水1000 mL,分別添加600、1200、1800 mg咖啡堿,121 ℃滅菌15 min制成不同咖啡堿濃度的固態篩選培養基。

咖啡堿液態培養基:水溶性淀粉4 g、葡萄糖20 g、氯霉素0.1 g、蒸餾水1000 mL,分別添加600、1200、1800 mg咖啡堿,121 ℃滅菌15 min制成不同咖啡堿濃度的液態培養基,用于產茶堿菌株的篩選。

PDA培養基:水溶性淀粉4 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、氯霉素0.1 g、蒸餾水1000 mL。

察氏固態培養基:硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、七水合硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 孢子菌懸液的制備 真菌菌株活化后,用無菌水進行洗脫,轉移至錐形瓶,充分振蕩搖勻,并調節孢子濃度約為1.0×108cfu/mL,于4 ℃保存備用。

1.2.2 目標菌株在固態培養基上的定性篩選 采用20 μL接種環分別挑取不同菌株的孢子菌懸液均勻涂抹在瓊脂葡萄糖固態培養基(自制:葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL,并調整pH為7)和不同咖啡堿濃度的無糖固態篩選培養基(分別調整pH為7)[21]。30 ℃倒置培養5 d后,觀察菌株菌落生長狀況,并測定菌落大小。

1.2.3 目標菌株的鑒定 DNA提取:目標菌株分別接種至PDA培養基以及察氏固態培養基,27 ℃培養觀察菌落生長狀況,并在高倍顯微鏡觀察菌株形態特征。并將目標菌株接種至察氏(CYA)液態培養基中培養、收集菌絲體、-80 ℃冷凍干燥后采取真菌DNA提取試劑盒法提取DNA。

PCR擴增:ITS序列通過引物ITS1和IST4進行擴增。PCR反應程序為:95 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min;54 ℃退火1 min;72 ℃延伸1.5 min;共35個循環;72 ℃延伸10 min。

rDNA序列分析:委托云南省微生物研究所對PCR產物通過DNA自動測序儀進行測序,并將所獲序列提交到NCBI的Genbank數據庫進行同源序列搜索,并調出相關菌株ITS1-5.8S-ITS2 rRNA基因序列,用ClustalX1.8軟件進行多序列比對,通過MEGA4軟件選用Kimura2-parameter距離模型計算進化距離,用Nerghbor-Joining 法構建系統發育樹,1000次隨機抽樣計算Bootstrap值以評估系統發育的置信度。

1.2.4 目標菌株的液態培養 分別將目標菌株孢子菌懸液(含有相應咖啡堿濃度)按5%(v/v)接種于600、1200和1800 mg/L不同底物濃度的咖啡堿液態培養基中(分別調整pH為7),30 ℃,180 r/min振蕩培養,在培養5、10和15 d時分別取樣,三次重復。液態培養基過濾后,在35 ℃下烘干24 h即為真菌細胞干重。采取高效液相色譜法(HPLC)測定不同階段液態培養基中咖啡堿、茶堿含量。

1.2.5 目標菌株的茶湯與茶葉單菌種發酵 按照1∶30 (w/v)的料液比將云南大葉種曬青毛茶在沸水中浸提15 min,過濾定容即為茶湯,茶湯中可溶物含量為10～15 g/L,用于茶湯的液態發酵。121 ℃滅菌15 min后,將目標菌株孢子菌懸液(相應茶湯為稀釋液)按5%(v/v)接種于滅菌茶湯中,30 ℃,180 r/min振蕩培養,在培養3、6、9、12、15 d時分別取樣,三次重復,采取HPLC測定不同發酵階段咖啡堿、茶堿含量。

稱取20 g曬青毛茶與12.25 mL蒸餾水混合,1×105Pa滅菌后,每培養瓶接種1 mL目標菌株的種子菌懸液,并以接種1 mL無菌水的發酵組作為對照。培養瓶均放置于恒溫恒濕培養箱內(30 ℃,85%)進行茶葉發酵。參照普洱茶渥堆發酵方法,每5 d取樣一次,三次平行重復,采取HPLC測定茶樣中咖啡堿、茶堿含量。

1.2.6 咖啡堿、茶堿含量測定 上樣液制備:稱取3 g磨碎試樣于500 mL錐形瓶中,加沸蒸餾水450 mL,立即移入沸水浴,浸提45 min(每隔10 min搖動一次)。浸提完畢后立即趁熱減壓過濾,并定容至500 mL。茶湯經0.45 μm水系膜過濾后進樣,進樣量為10 μL。咖啡堿液態培養基與茶湯發酵樣用去離子水稀釋5倍過濾后,直接上樣測定。

色譜條件[22]為:流動相為乙腈和0.2%乙酸水溶液的混合溶液,A相為乙腈,B相為0.2%乙酸水溶液,梯度洗脫,流速為1 mL/min,色譜柱:安捷倫反相Cl8色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);檢測波長為280 nm;柱溫為30 ℃。洗脫程序為:0 min,A相(%):8%,B相(%):92%;50 min,A相(%):31%,B相(%):69%。采取梯度洗脫。后運行10 min后進下一樣品。

1.2.7 咖啡堿轉化的動力學分析 參照Sirisansaneeyakul[23]對咖啡堿轉化為茶堿的動力學參數進行計算。C咖啡堿,f為咖啡堿最終濃度(mg/L),C茶堿e,f為茶堿最終濃度(mg/L);Q咖啡堿為單位時間內咖啡堿降解速率(mg/L d);Q茶堿為單位時間內茶堿產出速率(mg/L d);

茶堿收益率,即茶堿產出率與咖啡堿降解率的比例,計算公式如下:

茶堿收益率(%)=Q茶堿/Q咖啡堿×100

式(1)

啡堿降解率采用以下公式計算:

咖啡堿降解率(%)=(C0-Ct)/C0×100

式(2)

式(2)中:C0為初始咖啡堿濃度,mg/L,Ct為剩余咖啡堿濃度,mg/L。

1.3 數據統計分析

數據分析采用SPSS 20.0軟件。采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)分析不同組別之間差異的顯著性(p<0.05)水平。

2 結果與分析

2.1 潛在目的菌株的篩選

發現其中7株真菌菌株能夠在咖啡堿固態篩選培養基中存活,存活菌株菌落大小見表1。PE-4、PE-7僅能在高濃度(1200、1800 mg/L)咖啡堿固態篩選培養基中存活,可見兩株菌株對咖啡堿利用能力有限。PE-1、PE-2、PE-3、PE-5、PE-6等5株菌株在不同濃度的咖啡堿固態篩選培養基中均能成活,說明此五株菌株均能直接或間接利用咖啡堿作為碳源或氮源。其中,PE-1和PE-5在較低濃度(600 mg/L)的咖啡堿固態篩選培養基中生存良好。作為潛在目的菌株,對PE-1和PE-5進行分子生物學鑒定。

表1 茶葉分離菌株在含有葡萄糖的瓊脂固態培養基(對照)和僅有咖啡堿瓊脂培養基中生長情況

2.2 潛在目的菌株的鑒定

采用真菌通用引物ITS1和ITS4對PE-1和PE-5的ITS序列進行擴增,將獲得的18SrDNA序列在NCBI使用Blast比對,顯示PE-1與黑曲霉典型菌株AspergillusnigerNCBT110A同源性高達100%;PE-5與聚多曲霉典型菌株A.sydowiiNRRL250同源性為99.8%。結合目標菌株菌落特征、分生孢子顯微結構(圖1和圖2),將PE-1、PE-5分別鑒定為黑曲霉(A.nigerNCBT110A)(GenBank登錄號為JX863374)和聚多曲霉(A.sydowiiNRRL250)(GenBank登錄號為EF652450),同屬于曲霉屬真菌。

圖1 PE-1在光學顯微鏡下的形態特征

圖2 PE-5在光學顯微鏡下的形態特征

2.3 目標菌株在底物液態培養中茶堿產出結果分析

不同菌株在5、10、15 d時的真菌干重以及咖啡堿、茶堿含量如表2所示,聚多曲霉、黑曲霉在液態培養基中均生長良好。由于水溶性淀粉、葡糖糖等營養物的存在,黑曲霉優先利用水溶性淀粉、葡糖糖等營養物,咖啡堿的降解率僅為3%左右,未產生茶堿等降解產物。聚多曲霉對咖啡堿的降解作用不受糖類等營養物質存在的影響,在液態培養15 d時,咖啡堿降解率在99%以上,產生大量的茶堿。作為產茶堿的優勢菌株,本文對聚多曲霉在咖啡堿液態培養基中茶堿生成的動力學參數進行了分析,并探究聚多曲霉在茶湯液態發酵、茶葉固態發酵中茶堿的產出率。

表2 聚多曲霉與黑曲霉底物培養時咖啡堿的生物降解效率與茶堿濃度

2.4 聚多曲霉在咖啡堿液態培養基中茶堿生成動力學分析

將聚多曲霉菌懸液接種至含有1200 mg/L咖啡堿的液態培養中,分別測定不同階段真菌干重以及咖啡堿、茶堿含量,并通過相應方程式分析不同階段咖啡堿降解速率、茶堿產出速率、茶堿收益率以及咖啡堿降解率等動力學參數。聚多曲霉在1200 mg/L咖啡堿液態培養中,不同階段真菌干重以及咖啡堿轉化為茶堿的動力學參數見表3。隨著反應的進行,咖啡堿濃度逐漸降低,茶堿濃度逐漸增加;在15 d時,咖啡堿的降解率達90%以上,液態培養基中咖啡堿濃度僅為(105.0±16.9) mg/L,茶堿濃度高達(549.4±29.3) mg/L,在整個反應過程中,有將近一半的咖啡堿轉化為茶堿。由此可知,在聚多曲霉參與下,茶堿為咖啡堿的主要降解產物之一。

表3 聚多曲霉在咖啡堿液態培養基中茶堿生成動力學參數

2.5 不同底物濃度對茶堿產出率的影響

為探究咖啡堿濃度對茶堿產出率的影響,分別將聚多曲霉菌懸液接種至600、1200與1800 mg/L不同咖啡堿濃度的液態培養基中,振蕩培養15 d后,對液態培養基中真菌干重以及咖啡堿、茶堿濃度進行測定,不同底物初始濃度下,真菌干重以及動力學參數如表4所示。在不同底物濃度下,真菌干重無顯著性變化(p>0.05),顯示咖啡堿濃度對聚多曲霉生長不存在抑制作用;隨著底物濃度的提高,咖啡堿降解量與茶堿產出速率顯著性增加(p<0.05),而咖啡堿降解率顯著性下降(p<0.05),在1800 mg/L咖啡堿濃度下,咖啡堿的降解率僅為62.9%±2.1%。由此可知,聚多曲霉對咖啡堿的降解與轉化能力有限,在一定程度上受咖啡堿初始濃度的影響;在高咖啡堿初始濃度下,咖啡堿的降解速率無顯著性提高(p>0.05)。

表4 不同底物濃度茶堿生成動力學參數對照

2.6 聚多曲霉等菌株在茶堿生產中的應用

為考察目的菌株在高茶堿茶葉或茶飲料生產中的應用潛力,將聚多曲霉(PE-5)、黑曲霉(PE-1)菌懸液接種至已滅菌的茶湯與曬青毛茶中,并以滅菌處理作為對照,分別進行液態發酵與固態發酵,在不同階段采取HPLC對咖啡堿、茶堿含量進行測定。茶湯液態發酵與茶葉固態發酵不同處理,咖啡堿(A)和茶堿含量變化分別見圖3和圖4。如圖所示,在聚多曲霉茶湯液態發酵與茶葉固態發酵中,與咖啡堿液態培養基中變化規律一致,咖啡堿顯著下降,茶堿急劇增加;在發酵結束時,咖啡堿的降解率分別為85.43%和87.37%,茶堿含量分別為(501.2±13.55) mg/L和3.3293%±0.2463%(w/w),并成為主要嘌呤堿。在黑曲霉接種發酵與滅菌處理中,咖啡堿與茶堿均無顯著性變化。由此可知,聚多曲霉具有將咖啡堿轉化為茶堿的能力;在咖啡堿等前體物質存在情況下,聚多曲霉具有強大的轉化茶堿能力,可運用于高茶堿茶葉或茶飲料的生產中,從而提高茶葉的保健功效。

圖3 茶湯液態發酵過程中不同處理組咖啡堿(A)、茶堿(B)含量變化

圖4 茶葉固態發酵過程中不同處理組咖啡堿(A)、茶堿(B)含量變化

3 結論

本文采用以咖啡堿為底物的篩選培養基對普洱茶渥堆中分離純化的11種微生物進行了篩選,篩選出2株能利用咖啡堿的潛在菌株。經顯微結構觀察與18S rDNA序列測定,分別鑒定為黑曲霉(AspergillusnigerNCBT110A)和聚多曲霉(AspergillussydowiiNRRL250)。接種至含有600 mg/L咖啡堿的液態培養基進行培養發現,在水溶性淀粉、葡萄糖等營養物質存在下,黑曲霉對咖啡堿的利用受到限制,而聚多曲霉可促使咖啡堿大量轉化為茶堿。不同咖啡堿濃度驗證表明,聚多曲霉(A.sydowiiNRRL250)是一株有效的轉化茶堿菌株;在一定底物濃度下,咖啡堿的降解率在90%以上,并有一半以上的咖啡堿轉化為茶堿;在高底物濃度下,咖啡堿的降解速率與茶堿的產出速率均受到一定限制。

前人研究表明,聚多曲霉是一種安全有效的藥源真菌,能分泌產生多種具有抗癌活性的吲哚生物堿和雜氧蒽酮[24-25];并能分解纖維素[26]和生物降解甲基對硫磷[21],在工業與農藥的生物降解等方面有廣泛的應用前景。為探究聚多曲霉在高茶堿茶葉或茶飲料中的應用潛力,將聚多曲霉菌懸液分別接種至已滅菌的茶湯和曬青毛茶中進行液態發酵和固態發酵。在發酵結束時,咖啡堿的降解率分別為85.43%和87.37%,茶堿含量分別為(501.2±13.55) mg/L和3.3293%±0.2463%(w/w)。在咖啡堿等前體物質存在情況下,聚多曲霉是一株高效轉化茶堿的優勢菌株,為高茶堿普洱茶的開發提供了有效菌株。