超聲波法提取紫薯莖葉中總黃酮的工藝優(yōu)化

鄭 麗,彭 雪,張 悅,周瑾琨,催靜蕾,鄒基豪,劉振春

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118)

紫薯(Ipomoeabatatas(L.)Poir)為旋花科番薯屬紫薯種,又名黑薯,薯肉呈紫色至深紫色。它除了具有普通紅薯的營(yíng)養(yǎng)成分外,還富含硒元素和花青素[1],我國(guó)紫薯畝產(chǎn)量達(dá)2000～3000 kg[2]。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，總黃酮具有抗氧化[3]、消除體內(nèi)自由基[4]、抗衰老[5]、抗腫瘤[6]以及抗心血管疾病[7]等功能。在紫薯秧蔓的頂部約5～15 cm及嫩葉、葉柄統(tǒng)稱為紫薯莖葉[8],紫薯莖葉作為一種營(yíng)養(yǎng)豐富的紫薯副產(chǎn)物,主要用作牲畜飼料或廢棄物,在東北地區(qū)這種現(xiàn)象普遍存在[9-12]。若可以將紫薯的莖葉中大量潛在的總黃酮資源加以綜合利用,不僅會(huì)使紫薯的經(jīng)濟(jì)價(jià)值最大化,而且還可以保護(hù)環(huán)境。

黃酮類化合物根據(jù)其理化性質(zhì)，常用的提取方法有熱水提取法、有機(jī)溶劑提取法、超聲波提取法、酶解法、微波提取法以及超臨界流體萃取法[13-16]等。目前,超聲輔助乙醇提取技術(shù)在總黃酮類成分提取過程中的優(yōu)勢(shì)日益凸顯,超聲提取法是依據(jù)超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等加速細(xì)胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解,進(jìn)而顯著提高提取效率的一種方法[17],具有操作簡(jiǎn)單、無需加熱、減少提取時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。另有研究表明,響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝能直觀地反應(yīng)各因素的交互作用[18-19]。因此,本研究以紫薯莖葉為原料,主要考察了影響總黃酮提取的幾個(gè)單因素如超聲波功率、提取時(shí)間、提取溫度、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù),通過統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert里響應(yīng)面法的Box-Behnken模式,對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,以期獲得適宜的提取方法,為總黃酮的高效提取及紫薯莖葉的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫薯莖葉 采摘于吉林省長(zhǎng)春市蔬菜研究所范家屯鎮(zhèn)種植基地,俗名紫玫瑰,自然風(fēng)干后置于60 ℃的干燥箱中烘24 h,然后經(jīng)樣品粉碎機(jī)粉碎后過60目篩,密封于塑料袋中備用;蘆丁(標(biāo)品級(jí)) 天津一方科技有限公司;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉 分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

FZ102型微型植物式樣粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司;JY92-IIDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;FA2104型電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠;Anki TDL-4型離心器 上海安亭科學(xué)儀器廠;TU-1901型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;101A-3ET型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;FD-IB-50型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 新鮮紫薯莖葉自然風(fēng)干除雜→粉碎過篩(60目篩)→稱取紫薯莖葉粉末→石油醚脫脂(液料比10∶1 mL/g)→抽濾、干燥→乙醇溶解→超聲輔助提取→離心(5000 r/min,10 min)→上清液定容→NaNO2-Al(NO3)3顯色法顯色(參照文獻(xiàn)[20])→測(cè)定吸光度→計(jì)算總黃酮得率

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,硝酸鋁顯色法制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線,經(jīng)分析處理得到線性回歸方程。

1.2.3 總黃酮含量的測(cè)定 總黃酮測(cè)定參照倪曉霞等[21]報(bào)道的硝酸鋁顯色法略作改動(dòng)。將在不同條件下所得的樣品濾液稀釋到一定體積,準(zhǔn)確移取待測(cè)液0.5 mL于10 mL比色管內(nèi),加入5% NaNO20.3 mL,振蕩搖勻、靜止5 min,再加入10% Al(NO3)30.3 mL,搖勻、靜止5 min,然后加入4% NaOH 3.0 mL,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻、靜止15 min,空白對(duì)照采用相同體積的蒸餾水代替樣品溶液,在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度,結(jié)合公式(1)和標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,求出紫薯莖葉總黃酮的得率。

式(1)

式中:Y-紫薯莖葉總黃酮得率,%;C-紫薯莖葉總黃酮質(zhì)量濃度,mg/mL;N-稀釋的倍數(shù);m-稱取紫薯莖葉粉末的質(zhì)量,g;V-提取液體積,mL。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 提取溫度的選擇 設(shè)定液料比為20∶1 (mL/g),提取時(shí)間為50 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,超聲波功率為200 W,按以上提取方法考察提取溫度為30、40、50、60、70 ℃對(duì)紫薯莖葉總黃酮得率的影響。

1.2.4.2 超聲功率對(duì)紫薯莖葉總黃酮的影響 設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%,液料比為20∶1 (mL/g),提取時(shí)間為50 min,超聲溫度控制在50 ℃,考察超聲波功率為100、200、300、400、500、600 W時(shí)對(duì)紫薯莖葉總黃酮得率的影響。

1.2.4.3 提取時(shí)間對(duì)紫薯莖葉總黃酮的影響 設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%,液料比為20∶1 (mL/g),超聲功率為200 W,超聲溫度控制在50 ℃,考察提取時(shí)間為10、20、30、40、50、60 min 時(shí)對(duì)紫薯莖葉總黃酮得率的影響。

1.2.4.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫薯莖葉總黃酮的影響 設(shè)定液料比為20∶1 (mL/g),超聲功率為200 W,提取時(shí)間為50 min,超聲溫度控制在50 ℃,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)為55、60、65、70、75、80%時(shí)對(duì)紫薯莖葉總黃酮得率的影響。

1.2.4.5 液料比對(duì)紫薯莖葉總黃酮的影響 設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%,超聲功率為200 W,提取時(shí)間為50 min,超聲溫度控制在50 ℃,考察液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 (mL/g)時(shí)對(duì)紫薯莖葉總黃酮得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取對(duì)得率影響顯著的因素,按照Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步優(yōu)化提取總黃酮條件。實(shí)驗(yàn)因素水平和編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)三次取平均值,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖分析。實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)和模型構(gòu)建采用Design Expert 8.0.6軟件,數(shù)據(jù)處理采用Origin Pro 8.5進(jìn)行,統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 18.0軟件中的單因素ANOVA進(jìn)行,顯著性水平為p<0.05,極顯著水平為p<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度,并以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示,線性回歸方程為:y=0.26x+0.0215,R2=0.9922。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取溫度的選擇 由圖2可知,提取溫度對(duì)紫薯莖葉總黃酮的得率影響較小,其得率隨提取溫度的增加而增加,但是當(dāng)溫度超過50 ℃后,紫薯莖葉總黃酮的得率略有下降。本實(shí)驗(yàn)中總黃酮的得率隨提取溫度的變化趨勢(shì)與一些報(bào)道是相符的[22]。本研究選擇提取溫度為50 ℃。

圖2 提取溫度對(duì)紫薯莖葉總黃酮得率的影響

2.2.2 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響 超聲波功率對(duì)黃酮類化合物的提取有著很重要的影響[23-25]。由圖3可知,當(dāng)超聲功率小于200 W時(shí),隨著功率的升高,得率增加;當(dāng)超聲功率大于200 W時(shí),隨著功率的升高,得率減少;在超聲功率200 W時(shí)，達(dá)到最大值3.25%。這可能是因?yàn)椋谝欢ǖ某暡ㄗ饔脮r(shí)間下,隨著超聲功率的增加,超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等加速細(xì)胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解,但是,當(dāng)功率過高,溫度升高過快,加速乙醇有機(jī)溶劑的揮發(fā),黃酮類物質(zhì)溶出減少。這種現(xiàn)象與其它報(bào)道類似[26]。本研究選擇超聲功率為200 W作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

圖3 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 由圖4可知,紫薯莖葉中總黃酮的得率在10～50 min內(nèi)逐漸提高,在超聲時(shí)間50 min時(shí),得率獲得最大值,這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間小于50 min時(shí),超聲波的空化作用加速了細(xì)胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放;當(dāng)超聲達(dá)到一定時(shí)間后,繼續(xù)延長(zhǎng),總黃酮得率反而下降,可能因?yàn)槌晻r(shí)間過長(zhǎng),引起溫度升高,導(dǎo)致紫薯莖葉中部分黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞,進(jìn)而影響了總黃酮的溶出。在一些報(bào)道中，有些原材料提取總黃酮也觀察到類似現(xiàn)象[27]。本研究選擇提取時(shí)間50 min作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響 由圖5可知,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于75%時(shí),隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高,得率增加;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于75%時(shí),隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高,得率減少;在體積分?jǐn)?shù)75%時(shí)達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)不同導(dǎo)致極性有所差異,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)逐漸增加時(shí),總黃酮與蛋白質(zhì)等物質(zhì)之間形成的氫鍵遭到破壞,疏水相互作用力變強(qiáng),增加了黃酮類化合物的溶出,得率變大;而乙醇體積分?jǐn)?shù)過高,增加了紫薯莖葉中總黃酮與試劑間的極性差異,使得黃酮類物質(zhì)溶出減少。這種現(xiàn)象與其它報(bào)道類似[28]。本研究選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)75%作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率的影響

2.2.5 液料比對(duì)總黃酮得率的影響 由圖6可知,隨著液料比的增加,紫薯莖葉總黃酮得率不斷增大,在液料比為20∶1 (mL/g)時(shí)有最大值,而后液料比再增加,得率反而減少,可能原因是，當(dāng)乙醇體積用量多時(shí),溶解能力增加,總黃酮溶出增加,但是,溶劑用量過多,將一些醇溶性雜質(zhì)也溶出,致使得率減少。在一些報(bào)道中，有些原材料提取總黃酮也觀察到類似現(xiàn)象[29-31]。本研究選擇液料比20∶1 (mL/g)作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

圖6 液料比對(duì)總黃酮得率的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化總黃酮提取工藝條件

2.3.1 回歸模型的建立與顯著性分析 根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,以紫薯莖葉中總黃酮得率為響應(yīng)值,利用Design-Expert 8.06對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,經(jīng)因素回歸擬合,得到編碼值的二次多項(xiàng)回歸方程為:

表2 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及結(jié)果

Y=3.46+0.16A+0.12B+0.15C-0.063D-0.12AB-0.052AC+0.037AD+0.028BC-0.25BD+0.36CD-0.26A2-0.40B2-0.32C2-0.15D2

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)與方差分析

2.3.2 響應(yīng)面及等高線分析 各個(gè)因素之間的相互作用對(duì)紫薯莖葉中總黃酮得率的影響可以由響應(yīng)面及等高線反映出來,如圖7所示。根據(jù)表3與圖7可以得到,超聲時(shí)間(B)與超聲功率(A)交互作用對(duì)總黃酮得率影響顯著(p<0.05),BD和CD兩個(gè)交互作用比較明顯之外,其余交互項(xiàng)均不顯著(p>0.05)(影響不顯著的交互作用響應(yīng)面圖未列出)。交互作用不顯著可能是因素的主效應(yīng)在起作用[32]。曲線走勢(shì)越陡峭,表明該因素對(duì)總黃酮的得率影響越大;曲線走勢(shì)越平緩說明該因素對(duì)總黃酮得率影響較小[33-34]。研究結(jié)果表明,對(duì)紫薯莖葉總黃酮的得率影響最大的是超聲功率,其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間,這與表3中回歸分析結(jié)果相吻合。

圖7 各因素交互作用響應(yīng)面及等高線

2.4 提取工藝的優(yōu)化與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)Design-Expert 8.06分析優(yōu)化,得到超聲波法提取紫薯莖葉中總黃酮的最佳工藝條件為:液料比17.63∶1 (g/mL)、超聲時(shí)間51.88 min、超聲功率225.19 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)75.41%,在此條件下,根據(jù)方程得到總黃酮得率的預(yù)測(cè)值為3.51%。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性,采用優(yōu)化后的最佳提取條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),為了實(shí)驗(yàn)的可操作性,將最佳實(shí)驗(yàn)條件修正為:液料比18∶1 (g/mL)、超聲時(shí)間50 min、超聲功率200 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,進(jìn)行5次實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示,結(jié)果表明,采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),總黃酮得率為3.46%,預(yù)測(cè)值與實(shí)際值接近,說明該回歸模型優(yōu)化的配合工藝是有效的,由響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取紫薯莖葉中總黃酮的工藝有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

表4 優(yōu)化條件下的總黃酮得率

3 結(jié)論

針對(duì)東北地區(qū)紫薯莖葉資源,以優(yōu)化紫薯莖葉總黃酮的超聲輔助提取方法為目的,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上優(yōu)化提取工藝。確定最佳提取工藝為:液料比18∶1 (mL/g)、提取時(shí)間50 min、超聲功率200 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,在此條件下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),紫薯莖葉中總黃酮得率為3.46%。超聲波法輔助乙醇提取紫薯莖葉總黃酮,成本低,操作簡(jiǎn)潔方便。利用響應(yīng)面分析方法對(duì)超聲波輔助提取紫薯莖葉中黃酮的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,可以獲得最佳的工藝參數(shù),從而為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù),同時(shí),也為東北紫薯莖葉資源的開發(fā)利用提供可行性依據(jù)。