響應面法優化超聲波輔助提取正紅菇色素工藝

丁建英,徐亞男,姜 慧,張 嘯

(常熟理工學院生物與食品工程學院,江蘇常熟 215500)

正紅菇(Russulavinosalinolbl)是一種野生食用菌,其色澤呈紫紅色,味道鮮美[1],具有較高的營養價值,且有降膽固醇、治療失血性貧血、提高機體免疫力、抗癌、抗炎、增強血管收縮等藥理作用[2-3]。此外,正紅菇中還含有豐富的天然色素[4-5],色澤柔和、純正,作為天然食用色素具有很大的開發潛力和市場價值。天然色素不僅健康、安全、無毒副作用,并且含有天然動植物中的營養成分和藥理成分,是作為食用色素添加劑的理想選擇[6],目前對于天然色素研究主要集中在植物[7]和微生物[8-9],而對菌類色素的研究不多,關于正紅菇色素的提取方法的研究未見報道。超聲波輔助提取法的原理是通過超聲波產生的空化效應,使溶劑較快地進入固體物質,浸出更多的有效物質[10-11],已有不少研究[12-14]將該方法用于色素的提取,超聲波輔助提取操作簡單,節省溶劑,不易破壞提取物的構造,縮短了提取時間,且提取率高。響應面分析法常被用于優化工藝參數及檢驗各參數的交互影響,在功能成份的提取中得到廣泛應用[15-16]。

本文用超聲波輔助法提取正紅菇色素,以正紅菇色素提取液吸光度為指標,通過單因素實驗,考察超聲提取時間、提取溫度、乙醇體積分數對正紅菇色素提取效果的影響,并結合響應面實驗對正紅菇色素的提取工藝進行優化,以期為正紅菇的開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

正紅菇 福建長汀產;乙醇(AR) 國藥集團化學試劑有限公司。

HK-20B型中藥粉碎機 廣州市旭朗機械設備公司;KH-300B超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;EL104電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;RE-52A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器;DL-5-B離心機 上海圣科儀器設備有限公司;TU-1901雙光束紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;LSC冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 正紅菇色素最大吸收波長的測定 正紅菇去除雜質后,60 ℃干燥至恒重,粉碎過40目篩,得正紅菇粉末。稱取0.5 g正紅菇粉末加入25 mL50%乙醇溶液,40 ℃ 超聲提取30 min,在10000 r/min離心10 min,取上清液5 mL定容至50 mL,用紫外可見分光光度計在400～800 nm范圍內掃描,以確定正紅菇色素的最大吸收波長。

1.2.2 正紅菇色素提取工藝流程 正紅菇粉末→加入乙醇溶液→超聲處理→離心(10 min)→取上清液→定容→測吸光度(542 nm)。

1.2.3 單因素實驗 以正紅菇色素吸光度為指標進行單因素實驗,提取液乙醇濃度的影響:料液比1∶50 g/mL,提取溫度為40 ℃,乙醇濃度分別設置為30%、40%、50%、60%、70%;超聲提取時間的影響:料液比1∶50 g/mL,提取液為50%乙醇溶液,提取溫度為40 ℃,提取時間分別為10、20、30、40、50、60 min;提取溫度的影響:料液比1∶50 g/mL,提取液為50%乙醇溶液,提取時間為30 min,提取溫度分別為40、50、60、70、80、90 ℃;料液比的影響:提取液為50%乙醇溶液,提取溫度為40 ℃,提取時間為30 min,料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80 g/mL。

1.2.4 響應面優化實驗 根據單因素實驗結果,選擇超聲時間、提取溫度、料液比、乙醇濃度為響應變量,以542 nm處的吸光度為響應值,利用Design-Expert 7.0軟件對正紅菇色素超聲輔助提取工藝參數進行優化[17-19],響應面因素與水平見表1。

表1 響應面實驗因素水平表

1.3 數據處理

運用Excel 2010對文中數據進行統計處理。采用Design-Expert 7.0軟件進行響應面實驗設計及分析。

2 結果與討論

2.1 正紅菇色素的吸收光譜

將正紅菇色素提取液在400～800 nm可見光區波長范圍內進行掃描,得到的吸收光譜如圖1所示。由圖1可知,正紅菇色素在542 nm處有最大吸收峰,與李惠珍等[4]報導的正紅菇色素在可見光區最大吸收波長在542 nm處吸收最強相吻合,并且產生紅紫色。因此,本實驗選擇542 nm為正紅菇色素的最大吸收波長。

圖1 正紅菇色素的吸收光譜

2.2 正紅菇色素提取的單因素實驗結果

2.2.1 乙醇濃度對正紅菇色素提取效果的影響 乙醇濃度對正紅菇色素提取效果的影響如圖2所示。由圖2可知,乙醇濃度在30%～50%之間時,正紅菇色素提取液的吸光度值隨著乙醇體積分數的增大而增大;當乙醇濃度大于50%時,正紅菇色素提取液的吸光度值逐漸減小。這是由于隨著乙醇濃度的增加,乙醇作為有機溶劑,破壞色素與基質之間形成的鍵的能力,使色素溶解增加,導致吸光度增加;但另一方面隨著乙醇濃度增加,溶劑極性降低,又會降低水溶性色素的溶出,導致吸光度降低。溶劑的極性過高和過低時,都會降低色素的溶出,因此,適宜的乙醇濃度為50%。

圖2 乙醇濃度對色素提取液吸光度的影響

2.2.2 提取時間對正紅菇色素提取效果的影響 提取時間對正紅菇色素提取效果的影響如圖3所示。由圖3可知,當提取時間小于30 min時,正紅菇色素溶液吸光度隨著提取時間的增加而增加;當提取時間為30 min時，正紅菇色素溶液吸光度達到最大；當提取時間大于30 min時,正紅菇色素吸光度隨著提取時間的增加而減小。這是由于,超聲的空化效應增大了分子的運動速度、增大介質的穿透力,使溶劑快速進入固體物質中,同時提取初始階段提取溶劑與物料這間存在較大的濃度差,在此濃度差別下色素成份快速溶出,吸光度增大,但當超聲提取時間超過30 min后,超聲的機械效應、空化效應、熱效應可能破環正紅菇色素結構[20],導致吸光度下降,因此,適宜的超聲提取時間為30 min。

圖3 提取時間對色素提取液吸光度的影響

2.2.3 提取溫度對正紅菇色素提取效果的影響 提取溫度對正紅菇色素提取的影響如圖4所示。由圖4可知,提取溫度為40～70 ℃時,正紅菇色素提取液的吸光度逐漸增大,在70 ℃時吸光度最大,70 ℃后提取液的吸光度值不增反降,這是因為,隨著提取溫度的升高,色素分子間運動加速,使更多的色素分子溶解在乙醇溶劑中,使提取液吸光度值變大,但是溫度過高之后,導致色素分子結構被破壞,吸光度值也隨著減小。因此,適宜的超聲提取溫度為70 ℃。

圖4 提取溫度對色素提取液吸光度的影響

2.2.4 料液比對正紅菇色素提取效果的影響 料液比對正紅菇色素提取效果的影響如圖5所示。從圖5中可知,隨著料液比的增大,即為1∶30～1∶80 g/mL時,正紅菇色素吸光度下降,這是由于溶劑的增大,色素溶液相對稀釋所至。但考慮原料成本,料液比選擇1∶40 g/mL為佳。

圖5 料液比對色素提取液吸光度的影響

2.3 正紅菇色素提取響應面實驗結果

2.3.1 模型建立與方差分析 響應面實驗設計方案和結果見表2。利用Design Expert 7.0軟件對表2數據進行二次多項式回歸擬合,得到以下回歸方程:

表2 響應面實驗設計與結果

Y=2.96182+0.023167+6.651×10-3B+0.069432C+1.453×10-2D+2×10-5AB+2.5×10-4AC+2.725×10-4BD-2×10-5CD-2.51833×10-4A2-2.76833×10-4B2-5.05583×10-4C2-3.28083×10-4D2

對回歸模型進行方差分析,其結果見表3。由表3可見,該回歸模型具有高度顯著性(p<0.0001),失擬項不顯著(p>0.05),決定系數R2為0.9720,信噪比為18.751,表明該模型擬合度好,實驗誤差小。該模型能較準確的分析影響因素和響應值之間的關系,利用該方程模型可對正紅菇色素提取的最佳工藝條件進行分析。其中,自變量的一次系數A、C、D對響應值的影響極顯著(p<0.01),B對響應值的影響顯著(p<0.05),二次項A2、B2、C2、D2對響應值影響極顯著(p<0.01),根據F值分析,對色素提取效果影響大小的排列順序依次為:料液比>乙醇濃度>提取溫度>提取時間。

表3 回歸模擬方差分析

2.3.2 各因素的交互作用 根據表3回歸模擬方差分析及圖6～圖9各因素對正紅菇色素提取液的吸光度的響應面可知,提取時間和料液比(BD)的交互作用對吸光度影響極顯著(p<0.01),交互項乙醇濃度和提取時間(AB)、乙醇濃度和提取時間(AC)、提取時間和提取溫度(BC)的交互作用對吸光度影響顯著(p<0.05),而乙醇濃度和料液比(AD)、提取溫度和料液比(CD)的交互作用對吸光度影響不顯著(p>0.05)。

圖6 乙醇濃度與提取時間對色素提取液吸光度影響的響應曲面

圖7 乙醇濃度與提取溫度對色素提取液吸光度影響的響應曲面

圖8 提取時間與提取溫度對色素提取液吸光度影響的響應曲面

圖9 料液比與提取時間對色素提取液吸光度影響的響應曲面

2.3.3 回歸模型驗證 利用Design-Expert軟件,對多元二次響應面回歸方程求偏導,獲得超聲波輔助提取正紅菇色素的最佳工藝條件為:乙醇體積分數54.53%、提取時間28.85 min、提取溫度68.41 ℃、料液比1∶35.42 g/mL,理論吸光度值為0.406。為了便于實際操作,將色素提取的最佳工藝條件修正為:乙醇體積分數55%,提取時間為29 min,提取溫度為68 ℃,料液比為1∶35 g/mL。在此條件下,經過五次平行實驗,正紅菇色素吸光度為0.404±0.018,與理論值0.406相接近。說明本文對正紅菇色素的提取工藝的響應面法優化結果較可靠。

3 結論

本實驗用超聲波輔助法提取正紅菇色素,正紅菇色素的最大吸收波長為542 nm。采用響應面法對正紅菇色素的提取工藝進行了優化,其中,各因素對色素提取效果影響大小的排列順序依次為:料液比>乙醇濃度>提取溫度>提取時間,料液比、乙醇濃度、提取溫度對正紅菇色素的吸光度影響極顯著(p<0.01),提取時間對正紅菇色素的吸光度影響顯著(p<0.05)。最佳提取工藝條件為:乙醇體積分數為55%,提取時間為29 min,提取溫度為68 ℃,料液比為1∶35 g/mL。在最佳條件下,正紅菇色素的吸光度值為0.404±0.018,與理論值0.406相近,說明該色素提取工藝條件是合理可行的。本實驗用超聲波輔助法提取正紅菇色素,為正紅菇色素的高效提取提供了理論依據。