響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取正紅菇色素工藝

丁建英,徐亞男,姜 慧,張 嘯

(常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,江蘇常熟 215500)

正紅菇(Russulavinosalinolbl)是一種野生食用菌,其色澤呈紫紅色,味道鮮美[1],具有較高的營養(yǎng)價(jià)值,且有降膽固醇、治療失血性貧血、提高機(jī)體免疫力、抗癌、抗炎、增強(qiáng)血管收縮等藥理作用[2-3]。此外,正紅菇中還含有豐富的天然色素[4-5],色澤柔和、純正,作為天然食用色素具有很大的開發(fā)潛力和市場價(jià)值。天然色素不僅健康、安全、無毒副作用,并且含有天然動植物中的營養(yǎng)成分和藥理成分,是作為食用色素添加劑的理想選擇[6],目前對于天然色素研究主要集中在植物[7]和微生物[8-9],而對菌類色素的研究不多,關(guān)于正紅菇色素的提取方法的研究未見報(bào)道。超聲波輔助提取法的原理是通過超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng),使溶劑較快地進(jìn)入固體物質(zhì),浸出更多的有效物質(zhì)[10-11],已有不少研究[12-14]將該方法用于色素的提取,超聲波輔助提取操作簡單,節(jié)省溶劑,不易破壞提取物的構(gòu)造,縮短了提取時(shí)間,且提取率高。響應(yīng)面分析法常被用于優(yōu)化工藝參數(shù)及檢驗(yàn)各參數(shù)的交互影響,在功能成份的提取中得到廣泛應(yīng)用[15-16]。

本文用超聲波輔助法提取正紅菇色素,以正紅菇色素提取液吸光度為指標(biāo),通過單因素實(shí)驗(yàn),考察超聲提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)對正紅菇色素提取效果的影響,并結(jié)合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對正紅菇色素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,以期為正紅菇的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

正紅菇 福建長汀產(chǎn);乙醇(AR) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HK-20B型中藥粉碎機(jī) 廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備公司;KH-300B超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;EL104電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器;DL-5-B離心機(jī) 上海圣科儀器設(shè)備有限公司;TU-1901雙光束紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;LSC冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 正紅菇色素最大吸收波長的測定 正紅菇去除雜質(zhì)后,60 ℃干燥至恒重,粉碎過40目篩,得正紅菇粉末。稱取0.5 g正紅菇粉末加入25 mL50%乙醇溶液,40 ℃ 超聲提取30 min,在10000 r/min離心10 min,取上清液5 mL定容至50 mL,用紫外可見分光光度計(jì)在400～800 nm范圍內(nèi)掃描,以確定正紅菇色素的最大吸收波長。

1.2.2 正紅菇色素提取工藝流程 正紅菇粉末→加入乙醇溶液→超聲處理→離心(10 min)→取上清液→定容→測吸光度(542 nm)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以正紅菇色素吸光度為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),提取液乙醇濃度的影響:料液比1∶50 g/mL,提取溫度為40 ℃,乙醇濃度分別設(shè)置為30%、40%、50%、60%、70%;超聲提取時(shí)間的影響:料液比1∶50 g/mL,提取液為50%乙醇溶液,提取溫度為40 ℃,提取時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60 min;提取溫度的影響:料液比1∶50 g/mL,提取液為50%乙醇溶液,提取時(shí)間為30 min,提取溫度分別為40、50、60、70、80、90 ℃;料液比的影響:提取液為50%乙醇溶液,提取溫度為40 ℃,提取時(shí)間為30 min,料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80 g/mL。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇超聲時(shí)間、提取溫度、料液比、乙醇濃度為響應(yīng)變量,以542 nm處的吸光度為響應(yīng)值,利用Design-Expert 7.0軟件對正紅菇色素超聲輔助提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化[17-19],響應(yīng)面因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2010對文中數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。采用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 正紅菇色素的吸收光譜

將正紅菇色素提取液在400～800 nm可見光區(qū)波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,得到的吸收光譜如圖1所示。由圖1可知,正紅菇色素在542 nm處有最大吸收峰,與李惠珍等[4]報(bào)導(dǎo)的正紅菇色素在可見光區(qū)最大吸收波長在542 nm處吸收最強(qiáng)相吻合,并且產(chǎn)生紅紫色。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇542 nm為正紅菇色素的最大吸收波長。

圖1 正紅菇色素的吸收光譜

2.2 正紅菇色素提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對正紅菇色素提取效果的影響 乙醇濃度對正紅菇色素提取效果的影響如圖2所示。由圖2可知,乙醇濃度在30%～50%之間時(shí),正紅菇色素提取液的吸光度值隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大;當(dāng)乙醇濃度大于50%時(shí),正紅菇色素提取液的吸光度值逐漸減小。這是由于隨著乙醇濃度的增加,乙醇作為有機(jī)溶劑,破壞色素與基質(zhì)之間形成的鍵的能力,使色素溶解增加,導(dǎo)致吸光度增加;但另一方面隨著乙醇濃度增加,溶劑極性降低,又會降低水溶性色素的溶出,導(dǎo)致吸光度降低。溶劑的極性過高和過低時(shí),都會降低色素的溶出,因此,適宜的乙醇濃度為50%。

圖2 乙醇濃度對色素提取液吸光度的影響

2.2.2 提取時(shí)間對正紅菇色素提取效果的影響 提取時(shí)間對正紅菇色素提取效果的影響如圖3所示。由圖3可知,當(dāng)提取時(shí)間小于30 min時(shí),正紅菇色素溶液吸光度隨著提取時(shí)間的增加而增加;當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí)，正紅菇色素溶液吸光度達(dá)到最大；當(dāng)提取時(shí)間大于30 min時(shí),正紅菇色素吸光度隨著提取時(shí)間的增加而減小。這是由于,超聲的空化效應(yīng)增大了分子的運(yùn)動速度、增大介質(zhì)的穿透力,使溶劑快速進(jìn)入固體物質(zhì)中,同時(shí)提取初始階段提取溶劑與物料這間存在較大的濃度差,在此濃度差別下色素成份快速溶出,吸光度增大,但當(dāng)超聲提取時(shí)間超過30 min后,超聲的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)、熱效應(yīng)可能破環(huán)正紅菇色素結(jié)構(gòu)[20],導(dǎo)致吸光度下降,因此,適宜的超聲提取時(shí)間為30 min。

圖3 提取時(shí)間對色素提取液吸光度的影響

2.2.3 提取溫度對正紅菇色素提取效果的影響 提取溫度對正紅菇色素提取的影響如圖4所示。由圖4可知,提取溫度為40～70 ℃時(shí),正紅菇色素提取液的吸光度逐漸增大,在70 ℃時(shí)吸光度最大,70 ℃后提取液的吸光度值不增反降,這是因?yàn)?隨著提取溫度的升高,色素分子間運(yùn)動加速,使更多的色素分子溶解在乙醇溶劑中,使提取液吸光度值變大,但是溫度過高之后,導(dǎo)致色素分子結(jié)構(gòu)被破壞,吸光度值也隨著減小。因此,適宜的超聲提取溫度為70 ℃。

圖4 提取溫度對色素提取液吸光度的影響

2.2.4 料液比對正紅菇色素提取效果的影響 料液比對正紅菇色素提取效果的影響如圖5所示。從圖5中可知,隨著料液比的增大,即為1∶30～1∶80 g/mL時(shí),正紅菇色素吸光度下降,這是由于溶劑的增大,色素溶液相對稀釋所至。但考慮原料成本,料液比選擇1∶40 g/mL為佳。

圖5 料液比對色素提取液吸光度的影響

2.3 正紅菇色素提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 模型建立與方差分析 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表2。利用Design Expert 7.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合,得到以下回歸方程:

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Y=2.96182+0.023167+6.651×10-3B+0.069432C+1.453×10-2D+2×10-5AB+2.5×10-4AC+2.725×10-4BD-2×10-5CD-2.51833×10-4A2-2.76833×10-4B2-5.05583×10-4C2-3.28083×10-4D2

對回歸模型進(jìn)行方差分析,其結(jié)果見表3。由表3可見,該回歸模型具有高度顯著性(p<0.0001),失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05),決定系數(shù)R2為0.9720,信噪比為18.751,表明該模型擬合度好,實(shí)驗(yàn)誤差小。該模型能較準(zhǔn)確的分析影響因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系,利用該方程模型可對正紅菇色素提取的最佳工藝條件進(jìn)行分析。其中,自變量的一次系數(shù)A、C、D對響應(yīng)值的影響極顯著(p<0.01),B對響應(yīng)值的影響顯著(p<0.05),二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對響應(yīng)值影響極顯著(p<0.01),根據(jù)F值分析,對色素提取效果影響大小的排列順序依次為:料液比>乙醇濃度>提取溫度>提取時(shí)間。

表3 回歸模擬方差分析

2.3.2 各因素的交互作用 根據(jù)表3回歸模擬方差分析及圖6～圖9各因素對正紅菇色素提取液的吸光度的響應(yīng)面可知,提取時(shí)間和料液比(BD)的交互作用對吸光度影響極顯著(p<0.01),交互項(xiàng)乙醇濃度和提取時(shí)間(AB)、乙醇濃度和提取時(shí)間(AC)、提取時(shí)間和提取溫度(BC)的交互作用對吸光度影響顯著(p<0.05),而乙醇濃度和料液比(AD)、提取溫度和料液比(CD)的交互作用對吸光度影響不顯著(p>0.05)。

圖6 乙醇濃度與提取時(shí)間對色素提取液吸光度影響的響應(yīng)曲面

圖7 乙醇濃度與提取溫度對色素提取液吸光度影響的響應(yīng)曲面

圖8 提取時(shí)間與提取溫度對色素提取液吸光度影響的響應(yīng)曲面

圖9 料液比與提取時(shí)間對色素提取液吸光度影響的響應(yīng)曲面

2.3.3 回歸模型驗(yàn)證 利用Design-Expert軟件,對多元二次響應(yīng)面回歸方程求偏導(dǎo),獲得超聲波輔助提取正紅菇色素的最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)54.53%、提取時(shí)間28.85 min、提取溫度68.41 ℃、料液比1∶35.42 g/mL,理論吸光度值為0.406。為了便于實(shí)際操作,將色素提取的最佳工藝條件修正為:乙醇體積分?jǐn)?shù)55%,提取時(shí)間為29 min,提取溫度為68 ℃,料液比為1∶35 g/mL。在此條件下,經(jīng)過五次平行實(shí)驗(yàn),正紅菇色素吸光度為0.404±0.018,與理論值0.406相接近。說明本文對正紅菇色素的提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果較可靠。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)用超聲波輔助法提取正紅菇色素,正紅菇色素的最大吸收波長為542 nm。采用響應(yīng)面法對正紅菇色素的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,其中,各因素對色素提取效果影響大小的排列順序依次為:料液比>乙醇濃度>提取溫度>提取時(shí)間,料液比、乙醇濃度、提取溫度對正紅菇色素的吸光度影響極顯著(p<0.01),提取時(shí)間對正紅菇色素的吸光度影響顯著(p<0.05)。最佳提取工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%,提取時(shí)間為29 min,提取溫度為68 ℃,料液比為1∶35 g/mL。在最佳條件下,正紅菇色素的吸光度值為0.404±0.018,與理論值0.406相近,說明該色素提取工藝條件是合理可行的。本實(shí)驗(yàn)用超聲波輔助法提取正紅菇色素,為正紅菇色素的高效提取提供了理論依據(jù)。