利用黑曲霉B1401發酵廢棄茶末浸提液產單寧酶的工藝優化

胡 娜,吳鑫穎,*,邱樹毅,*,王 艷,唐佳代

(1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州貴陽 550025;2.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州貴陽 550025)

單寧酶(EC3.1.1.20)是一種細胞膜結合酶,能夠水解單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵,生成葡萄糖、沒食子酸[1],該酶應用廣泛,主要應用于精細化工、皮革、飼料、制藥、食品飲料等領域[2]。能夠產生單寧酶的微生物來源十分豐富,主要是真菌類的曲霉屬、青霉屬和根霉屬等,尤其是曲霉屬中的黑曲霉、米曲霉和黃曲霉[3]。其中由于黑曲霉具有生長迅速、發酵周期短等優點,而使得目前研究較多較深入的是黑曲霉[4]。

貴州是茶生產與消費大省,茶樹的發源地之一。在茶葉生產過程中,會產生大量的廢棄茶末,既污染環境，又造成生物資源的巨大浪費。茶末浸提液主要化學成分是茶多酚、氨基酸、黃酮化合物、酯型兒茶素、蛋白質、茶多糖、果膠質和咖啡堿等[5],于是考慮將茶末浸提液作為培養基供微生物利用。本實驗創新性地利用廢棄茶末浸提液作為發酵培養基,對黑曲霉B1401產單寧酶的發酵條件進行優化,以提高單寧酶酶活，為廢棄茶末的利用提供新思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉B1401 貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室保藏;廢棄茶末 貴州省遵義市湄潭縣某茶廠;氫氧化鈉、蔗糖、尿素、可溶性淀粉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硝酸鈉、硫酸銨、單寧酸、沒食子酸、氯化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、繞丹寧、沒食子酸丙酯、鉬酸鈉、碳酸鈉等 均為分析純,成都金山化學試劑有限公司;斜面培養基 1%單寧酸,2%蔗糖,0.3% NaNO3,0.1% K2HPO4·3H2O,0.05% MgSO4·7H2O,0.05% KCl,0.001% FeSO4,4%瓊脂,pH4.5左右,用于菌種保藏;液體培養基 1%(NH4)2SO4,0.1%MgSO4·7H2O,0.1%NaNO3,0.1%K2HPO4·3H2O,pH5.0,用于黑曲霉產單寧酶的液態發酵培養。

721s可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;MJX-250B-Z霉菌培養箱、BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;JJ-CJ-1FD潔凈工作臺 蘇州市金凈凈化設備科技有限公司;DK-98-11電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;PHS-3C pH計 上海虹誼儀器儀表有限公司等;BCD-215DK冰箱 青島海爾股份有限公司;ECLIPSE-E200顯微鏡 Nikon公司;SHZ-Ⅲ循環水式真空泵 上海亞榮生化儀器廠;MutlifugeX1R高速冷凍離心機 德國Themo Scietific Heraeus;ZWY-111B恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;HC-280T2高速多功能粉碎機 永康市綠可食品機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備 黑曲霉B1401菌株轉接入菌種斜面保藏培養基中，30 ℃培養96 h,獲得出發菌株。在試管斜面中加入10 mL的無菌生理鹽水,在無菌操作臺中酒精燈旁，用接種環刮下孢子,振蕩培養1 h,使孢子充分分散,制成孢子菌懸液,經血球計數板鏡檢,使菌種數達到108/mL的水平。

1.2.2 茶末浸提液的制備 準確稱取3.000 g粉碎的茶末(用粉碎機將廢棄茶末粉碎至40～60目)于100 mL燒杯中,加入90 mL預熱至95 ℃的蒸餾水,搖動使茶葉完全濕潤,立即移入95 ℃的水浴鍋中,浸提20 min(中途攪拌2～3次),浸提完成后用快速定性濾紙過濾得到浸提液[6]。

1.2.3 茶末浸提液中茶多酚、單寧酸含量的測定 茶多酚含量的測定參照國標GB/T 8313-2008方法二——茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法[9]。單寧酸含量的測定參考NY/T1600-2008分光光度法[10]。對茶末浸提液的茶多酚、單寧酸含量進行測定,測得其茶多酚含量為12%,單寧酸含量為8%。

1.2.4 茶末浸提液的發酵 由預實驗得,3%茶多酚+6%單寧酸復配下產酶效果好。于是將制得的茶末浸提液稀釋4倍后備用,此時浸提液中單寧酸含量2%、茶多酚含量3%。向90 mL/250 mL茶末浸提液培養基中添加4%的單寧酸,接種量1%,搖勻后用紗布封口置于140 r·min-1、30 ℃的搖床中培養72 h。

1.2.5 單因素設計

1.2.5.1 培養基條件優化 a.誘導物對菌株產單寧酶的影響:在90 mL/250 mL液態培養基中添加6%單寧酸、3%茶多酚、6%單寧酸+3%茶多酚,接種1%,30 ℃、140 r·min-1搖床中培養,分別在培養時間為24、48、60、72、84、96、108 h時,收集菌體,測定胞內酶酶活,考察不同誘導物對單寧酶酶活的影響。

b.碳源復配對單寧酶酶活的影響:將茶末浸提液培養基中的總碳源固定在1%,其中慢速利用碳源淀粉與快速利用碳源蔗糖比分別配成0.1∶0.9、0.3∶0.7、0.5∶0.5、0.7∶0.3、0.9∶0.1,其余組分不變,接種1%,30 ℃、140 r·min-1搖床中培養72 h。收集菌體測定胞內酶酶活,考察碳源復配比對單寧酶酶活的影響。

c.氮源復配對單寧酶酶活的影響:將茶末浸提液發酵培養基中的總氮源固定在1%,其中慢速利用氮源尿素與快速利用氮源硝酸鈉比分別配成0.1∶0.9、0.3∶0.7、0.5∶0.5、0.7∶0.3、0.9∶0.1,其余組分不變,接種1%,30 ℃、140r·min-1搖床中培養72 h。收集菌體測定胞內酶酶活,考察氮源復配比對單寧酶酶活的影響。

d.無機鹽離子對單寧酶酶活的影響:在茶末浸提液發酵培養基中添加0.05%的K2HPO4、NaCl、CaCl2、MgSO4、CuSO4、MnSO4、ZnSO4,其余成分不變,接種1%,30 ℃、140 r·min-1搖床中培養72 h。收集菌體測定胞內酶酶活,考察無機鹽離子對單寧酶酶活的影響。

e.表面活性劑對單寧酶酶活的影響:在茶末浸提液發酵培養基中添加0.02%的EDTA、吐溫-80、SDS、Triton X-100,其余成分不變,接種1%,30 ℃、140 r·min-1搖床中培養72 h。收集菌體測定胞內酶酶活,考察表面活性劑對單寧酶酶活的影響。

1.2.5.2 培養條件優化 a.培養時間對單寧酶酶活的影響:在90 mL/250 mL的茶末浸提液培養基中，接種1%,30 ℃、140 r·min-1搖床中培養,收集菌體測定胞內酶酶活,考察培養時間對單寧酶酶活及菌體干重的影響。

b.裝液量對單寧酶酶活的影響:在250 mL三角瓶中添加50、70、90、100、110 mL的茶末浸提液,接種1%,30 ℃、140 r·min-1搖床中培養72 h,收集菌體測定胞內酶酶活,考察裝液量對單寧酶酶活的影響。

c.轉速對單寧酶酶活的影響:在裝有90 mL/250 mL的茶末浸提液發酵培養基中接種1%,轉速控制在120、140、160、180、200 r·min-1,30 ℃培養72 h。收集菌體測定胞內酶酶活,考察轉速對單寧酶酶活的影響。

d.培養溫度對單寧酶酶活的影響:在裝有90 mL/250 mL的茶末浸提液發酵培養基中接種1%,溫度分別控制在28、30、32、34、36 ℃,140 r·min-1搖床中培養72 h。收集菌體測定胞內酶酶活,考察溫度對單寧酶酶活的影響。

e.接種量對單寧酶酶活的影響:在裝有90 mL/250 mL的茶末浸提液發酵培養基中接種,接種量分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%,30 ℃、140 r·min-1搖床中培養72 h。收集菌體測定胞內酶酶活,考察接種量對單寧酶酶活的影響。

1.2.6 Plackett-Burman實驗設計 根據單因素的結果,在以上9個因素中,無機鹽離子、表面活性劑對單寧酶酶活的影響很小,碳源、氮源、培養時間、裝液量、轉速、培養溫度、接種量這7個因素對單寧酶酶活有較大影響,所以對以上7個因子選取2個水平進行PB實驗設計,高水平為低水平的1.5倍,因素水平表見表1。

表1 PB實驗因素水平表

1.2.7 響應面實驗設計 采用Box-Behnken,以單寧酶酶活為指標,對碳源比、裝液量、轉速進行優化。實驗因素與水平見表2。

表2 響應面實驗因素水平表

1.2.8 粗酶液的提取 過濾發酵培養液,收集發酵菌絲。黑曲霉液態發酵產的單寧酶為胞內酶。于是將菌絲分為兩部分,一部分在103±2 ℃烘干至恒重,用于測定菌體干重,另一部分用于測定酶活,首先將收集到的菌絲體-20 ℃冷凍3 h左右,再將菌絲、石英砂、檸檬酸緩沖液按質量比1∶1∶5在冰浴的條件下研磨、破碎細胞,在4 ℃低溫8000 r·min-1離心機下離心30 min,最后收集離心上清液定容到25 mL作為待測胞內酶粗酶液。

1.2.9 酶活的測定 酶活的定義:在40 ℃,pH=5.0條件下,每分鐘內水解底物沒食子酸丙酯產生1 μmoL沒食子酸所需的酶量定義為一個酶活力單位。

酶活的測定方法:按照保玉心[7]的方法并做相關改進,并根據以下公式進行計算。

X=ΔA520×585.68×5×100×0.001/10 min/g=29.28×ΔA520/g

式中:X-酶活力,U/gds;ΔA520=(Atest-Ablank)-(Acontrol-Ablank);585.68-沒食子酸標準曲線回歸方程的斜率;5-最后稀釋的倍數;100-0.25 mL酶液轉換成50 mL總酶液的倍數;0.001-μmol/L變換μmol/mL的倍數;10 min-單寧酶催化底物反應的時間;g-菌體在(103±2) ℃條件下烘干至恒重的質量。

1.2.10 驗證實驗 對響應面法得到的最優組合條件進行驗證,設置5組平行驗證實驗,驗證模型的有效性。

1.3 數據處理

所有實驗數據均重復3次,Origin 8.6軟件作圖,運用Design-expert(version 8.0.6.1)分析軟件進行數據分析處理。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 培養基條件優化

2.1.1.1 誘導物對單寧酶酶活的影響 不同誘導物復配比對單寧酶酶活的影響見圖1,在以上3種條件中,單寧酸與茶多酚復配結果最好;單寧酸次之,茶多酚最差;同時發現在單寧酸與茶多酚復配條件下,單寧酶酶活在發酵第72 h達到了最大值,早于單寧酸與茶多酚條件下的最佳產酶時間。之后三者都呈現出隨著發酵時間的延長,單寧酶酶活逐漸下降的趨勢。所以,最終確定最佳誘導物為6%單寧酸與3%茶多酚復配,后續實驗優化都是在這個最佳誘導物基礎上進行的。

圖1 誘導物對單寧酶酶活的影響

2.1.1.2 碳源復配對單寧酶酶活的影響 碳源對單寧酶酶活的影響見圖2,產酶隨慢速利用碳源淀粉與快速利用碳源蔗糖的比例的增大先增加后減少,當慢速利用碳源淀粉與快速利用碳源蔗糖的比例為0.7%∶0.3%(w/v)時,酶活力達到最大值。碳源分為慢速利用碳源和快速利用碳源,兩者的合適比例可保證菌種的適度生長,避免過高的葡萄糖濃度抑制單寧酶合成的現象,有助于提高單寧酶產量[10]。所以,最終選擇產酶最適的慢速利用碳源淀粉與快速利用碳源蔗糖的比例為0.7%∶0.3%(w/v)。

圖2 不同碳源比例對單寧酶酶活的影響

2.1.1.3 氮源復配對單寧酶酶活的影響 氮源對單寧酶酶活的影響見圖3,產酶隨尿素與硝酸鈉比例的增大先增加后減少,當尿素與硝酸鈉的比例為0.3%∶0.7%(w/v)時,酶活力達到最大值。無機氮源成分單一,質量穩定,可被快速利用,同時有機氮源除含有豐富的蛋白質、肽類、游離的氨基酸以外,還含有少量的糖類、脂肪和生長因子等,微生物在含有機氮源的培養基中常表現出生長旺盛、菌體濃度增長迅速等特點。因而在工業化生產中,通常使用有機氮與無機氮的混合氮源。此外,該結果與文獻[11]中報道的尿素、硝酸鈉作為氮源菌株生長及產酶情況均較理想一致。所以,最終選擇產酶最適的尿素與硝酸鈉的比例為0.3%∶0.7%(w/v)。

圖3 不同氮源比例對單寧酶酶活的影響

2.1.1.4 無機鹽離子對單寧酶酶活的影響 無機鹽離子對單寧酶酶活的影響見圖4,添加的無機鹽離子均對單寧酶酶活產生不同程度的抑制作用,其中K2HPO4、MgSO4抑制作用較弱,MnSO4抑制效果最強。Hossam S.Hamdy等[12]研究發現Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+等離子對單寧酶酶活有激活作用,而Ba2+、Co2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+有抑制作用。朱繼新等[13]研究發現Zn2+在低濃度下對單寧酶酶活有促進作用,而Fe3+、Fe2+、Cu2+有抑制作用。李秧針等[14]研究發現Fe3+、Cu2+、Fe2+、Ba2+、Mn2+、Ca2+、Al3+等對單寧酶酶活有抑制作用。李紅歌等[15]研究發現K+、Ag+、Zn2+等金屬離子可促進酶促反應的進行,Na+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Hg2+、Co2+、Mn2+、Cu2+、Ba2+、Fe2+均能在不同程度上抑制酶活力。根據以上結果,所以最終選擇不在培養基中添加額外的金屬離子。

圖4 不同無機鹽離子對單寧酶酶活的影響

2.1.1.5 表面活性劑對單寧酶酶活的影響 表面活性劑對單寧酶酶活的影響見圖5,添加的表面活性劑均對單寧酶酶活產生不同程度的抑制作用,其中EDTA抑制作用最強。該實驗結果與Battestin和Macedo[16]等報道的Tween80、Triton X-100、EDTA均能抑制單寧酶酶活一致。表面活性劑之所以能夠抑制單寧酶的活性,這是因為這些組分附于單寧酶的疏水表面,占據了酶的活性中心,使酶與底物的結合作用減少，從而抑制酶活力。目前文獻報道的關于表面活性劑及螯合劑對單寧酶酶活的影響不盡一致。李秧針等[14]報道吐溫80、EDTA對黑曲霉B0201發酵產單寧酶影響不明顯。倪田表等[17]報道單寧酶酶活被表面活性劑十二烷基磺酸鈉、吐溫-80 完全抑制,而在聚乙二醇辛基苯基醚中酶活保持穩定。根據以上結果,所以最終選擇不在培養基中添加額外的表面活性劑及螯合劑。

圖5 不同表面活性劑對單寧酶酶活的影響

2.1.2 培養條件優化

2.1.2.1 培養時間對單寧酶酶活及菌體干重的影響 培養時間對單寧酶酶活及菌體干重的影響見圖6,單寧酶酶活力隨時間的增加而增加,在72 h時達到最大值,然后隨時間的延長不斷減少。發酵前期,菌絲未完全生長,產酶量較小,酶活力較低;黑曲霉以單寧為碳源,單寧誘導黑曲霉產單寧酶,分解單寧,因此單寧酶的產量增加,當培養至72 h時,酶活達到最大值。菌體量和酶活未同時達到最大值,可能是因為后期單寧酸及茶多酚等誘導物減少,酶產量下降但是營養物質足夠,菌體繼續生長。后期菌體出現衰老,可能是因為發酵后期培養基營養物質不足導致的[18-19]。所以,最終選擇的產酶最適培養時間為72 h。

圖6 培養時間對單寧酶酶活的影響

2.1.2.2 裝液量對單寧酶酶活的影響 裝液量對單寧酶酶活的影響見圖7,隨著裝液量的增加，單寧酶酶活力先上升后下降。當裝液量為90 mL/250 mL時,單寧酶酶活達到最大值。這是因為在恒定的三角瓶中裝載量過少,溶解氧低,使培養基粘度增大,攪拌難度增加;裝液量過大,就會減少錐瓶中換氣的空間,造成發酵液中溶氧量不足。所以,最終選擇的產酶最適裝液量為90 mL/250 mL。

圖7 裝液量對單寧酶酶活的影響

2.1.2.3 轉速對單寧酶酶活的影響 轉速對單寧酶酶活的影響見圖8,隨著搖床轉速的增大,單寧酶酶活力先增加后降低。當搖床轉速為140 r·min-1時,單寧酶活力達到最大值。一方面,轉速的大小決定了培養液中菌絲球所受機械力的大小。另一方面,轉速與培養體系的溶氧狀況有關,適宜的溶氧濃度有利于菌株生長代謝。轉速過低時，不利于產菌體和培養基的充分混合及溶氧;轉速過大時，培養液在三角瓶中易形成“打旋”現象,反而不利于物質的充分混合,不利于產酶。所以,最終選擇產酶最適轉速為140 r·min-1。

圖8 轉速對單寧酶酶活的影響

2.1.2.4 培養溫度對單寧酶酶活的影響 培養溫度對單寧酶酶活的影響見圖9,單寧酶酶活力隨著溫度的升高先增加后減少,在30 ℃時達到最大值。溫度的變化對菌體生產單寧酶有一定的影響:當溫度較低的時候,黑曲霉生長速度比較慢,發酵產酶受抑制;當溫度升高,反應速率加快,生長代謝加快,微生物代謝物產量提高。但是溫度過高時,也會抑制霉菌的生長甚至殺死微生物。所以,最終選擇產酶最適的培養溫度為30 ℃。

圖9 培養溫度對單寧酶酶活的影響

2.1.2.5 接種量對單寧酶酶活的影響 接種量對單寧酶酶活的影響見圖10,單寧酶酶活力隨接種量的增大先增加后減少,接種量在1%時,酶活力達到最大值。這說明在相同的培養基中,同等發酵條件下,如果孢子數過少,其產酶效果不好;但如果接種量過大,培養基中的營養物質供應不足,將會導致細胞衰亡,產酶量也受抑制[20]。所以,最終選擇產酶最適的接種量為1%。

圖10 接種量對單寧酶酶活的影響

2.2 PB實驗結果與分析

PB實驗結果見表3、各因素影響情況見表4及PB實驗設計主效應分析結果見表5。

表3 PB實驗結果

表4 各因素對發酵培養基產單寧酶影響

表5 PB實驗設計主效應分析結果

由表4可知,在PB設計的二水平范圍內,碳源比、裝液量、溫度及時間對單寧酶酶活為負效應,而氮源比、接種量及溫度對單寧酶酶活為正效應。即在本實驗范圍內,隨著氮源比、接種量及轉速的增加,單寧酶酶活呈上升趨勢,相反隨著碳源比、裝液量、溫度及時間的降低,單寧酶酶活呈上升趨勢。由表4可知,這7個因素對單寧酶酶活提高的影響順序依次為:轉速>裝液量>碳源比>氮源比>時間>接種量>溫度。因此,選擇轉速、裝液量和碳源比這三個顯著因素進行下一步優化。

2.3 響應面實驗結果與分析

表6 響應面實驗設計與結果

表7 響應面實驗方差分析

根據擬合函數,每兩個因素對單寧酶酶活繪制響應面和等高線。如圖11～圖13立體分析圖所示,響應曲面圖可以形象地描述各因素之間的交互作用,等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強弱,橢圓形表示交互作用強,圓形表示交互作用弱[22]。碳源比和裝液量、裝液量和轉速交互作用顯著,而碳源比和轉速交互作用不顯著。每兩個因素之間的影響基本呈拋物線型關系,且均有一個極值點,變化趨勢都是先增大后減少。

圖11 響應面法(碳源比、轉速)立體分析圖和相應等高線

圖12 響應面法(裝液量、轉速)立體分析圖和相應等高線

圖13 響應面法(碳源比、裝液量)立體分析圖和相應等高線

2.4 驗證實驗結果

由軟件分析得出:當碳源比(A)為2.94，即可溶性淀粉∶蔗糖=0.746%∶0.254%、裝液量(B)為90.25 mL/250 mL、轉速(C)為139.57 r·min-1時,響應值達到最大值,酶活力為105.14 U/g。

為了驗證模型的準確性,在預測最佳培養基配方條件下進行發酵實驗。由于預測的值中存在小數,考慮到實際情況,從而將裝液量調整為90 mL/250 mL、轉速調整為140 r·min-1,進行5次平行實驗,實驗結果單寧酶活力為(104.82±1.44) U/g。

由上可知,實際測得值104.82 U/g與預測值105.14 U/g十分接近,表明響應面法對茶末浸提液液態發酵產單寧酶的優化是可行的且具有實際應用價值。

3 結論與展望

本實驗探索了廢茶末浸提液液態搖瓶發酵制備單寧酶的工藝,為廢茶末的綜合利用提供了新的途徑。不僅實現了廢物利用,變廢為寶,而且利用茶湯中的茶多酚作為誘導物產單寧酶,使得單寧酶酶活遠高于國內外目前利用廢棄物產酶的酶活值。對產酶誘導物進行了探索,同時在此基礎上運用單因素實驗、PB實驗、BB響應面實驗對培養基成分及培養條件進行了優化,得到了最優的培養基配方與發酵條件。最佳誘導物為6%單寧酸+3%茶多酚,最佳碳源為復配碳源即0.746%可溶性淀粉:0.254%蔗糖,氮源為復配氮源即0.3%尿素:0.7%硝酸鈉,接種量為1%,裝液量為90 mL/250 mL,轉速為140 r·min-1,發酵溫度為30 ℃、發酵時間為72 h,此條件下單寧酶酶活可達104.82 U/g。