HPLC法同時測定小根蒜中8種堿基和核苷類成分的含量

黃 瑜,丁 博,張德全,譚萬森,周 濃,*

(1.大理大學藥學與化學學院,云南大理 671000;2.重慶三峽學院生物與食品工程學院,三峽庫區道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室,重慶 404120)

小根蒜(AlliummacrostemonBunge.)為百合科蔥屬多年生草本植物[1],始載于《神農本草經》,列為中品[2],為《中國藥典》(2015年版一部)收載品薤白來源之一,以鱗莖入藥,具有通陽散結,行氣導滯之功效[3]?，F代研究表明,小根蒜中含有揮發油、甾體皂苷、含氮化合物(包括腺苷、胸苷等)、含硫化合物、多糖等化學成分[4-7],具有抗腫瘤、抗炎、延緩衰老、擴張血管、提高機體免疫力等藥理作用[8-12]。

核苷類成分是細胞的重要組成部分,作為生物活性成分,其對機體的免疫系統、代謝系統、神經系統及心血管系統等有著很強的調節作用,是改善人類健康和預防疾病的重要組成成分之一[13]。小根蒜(薤白)作為傳統的藥食同源植物,應用多以水為溶劑進行加工,其水溶性活性成分的生物活性研究已受到一定的關注,小根蒜具有紫外吸收的水溶性成分主要是核苷類物質[14-16]。因此,小根蒜所含核苷類成分可作為小根蒜質量評價指標之一,核苷類成分已被證實是重要的生物活性成分,與小根蒜生物活性(抗腫瘤、抗氧化、增強免疫功能等)[8-12]具有一定的關聯性。目前,針對小根蒜(薤白)中核苷類含量的檢測報道較多[14-16],但對不同產地、不同部位小根蒜中尿嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤、胸苷、2′-脫氧腺苷8種堿基和核苷的同時測定未見報道。為此,本文采用HPLC法同時測定不同產地小根蒜中8種堿基和核苷類含量,對小根蒜的質量評價標準進行補充。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小根蒜植株 2014年09月至2014年10月,自采或委托采集于重慶市萬州區新鄉鎮等小根蒜種植基地,經重慶三峽學院生物與食品工程學院周濃教授鑒定為百合科蔥屬小根蒜Alliummacrostemon的干燥全株(見表1);小根蒜洗凈后,35 ℃下烘箱烘干,粉碎后過50目篩。尿嘧啶對照品(批號:100469-200401)、鳥嘌呤對照品(批號:140631-201205)、尿苷對照品(批號:110887-200202)、腺嘌呤對照品(批號:886-200001)、胸苷對照品(批號:101215-201401)、腺苷對照品(批號:110879-200202) 由中國食品藥品檢定研究院提供;鳥苷對照品、2′-脫氧腺苷對照品 純度>98%,南京都萊生物技術有限公司;甲醇色譜純 德國Merck公司,水 娃哈哈牌純凈水。

表1 樣品來源

LC-20A型高效液相色譜儀、PDA檢測器 日本島津集團;SB-12D型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;TDZ4-WS型多管架自動平衡離心機 湖南平凡科技有限公司;ML204型分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備 分別稱取尿嘧啶、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷對照品,加純凈水溶解對照品,并制成質量濃度分別為40.00、21.00、330.00、22.00、399.00、118.00、118.00、103.00 μg/mL的對照品溶液,用0.45 μm混合纖維素微孔濾膜濾過,備用。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取小根蒜樣品粉末(過50目篩)0.5 g,置100 mL具塞錐形瓶中,精密加蒸餾水25 mL,混勻,25 ℃室溫下超聲提取60 min(超聲功率600 W,工作頻率40 kHz),放至室溫,搖勻,倒入離心管中,離心10 min(4000 r·min-1),用0.45 μm微孔濾膜過濾,即得到供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 色譜柱為Venusil MP C18(2)柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為A相為甲醇,B相為水,梯度洗脫(0 min→10 min→15 min→20 min→30 min,1% A→5% A→15% A→20% A→30% A);檢測波長:260 nm;體積流量:1.0 mL/min;進樣量:10 μL;柱溫:35 ℃。

1.2.4 檢出限和定量限 將制備好的對照品溶液進行逐級稀釋后,依次進樣10 μL,當信噪比等于3時,所對應的對照品溶液的質量濃度為最低檢出限;當信噪比等于10時,所對應的對照品溶液的質量濃度為最低定量限。

1.3 數據處理

采用SPSS 23.0軟件對不同產地的14份小根蒜鱗莖中8種堿基和核苷的含量進行聚類分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 對照品和供試品色譜分離圖

按照上述色譜條件進行分析,各成分分離度良好,混合對照品和小根蒜樣品(S10)色譜圖見圖1。

圖1 核苷混合對照品(A)及小根蒜樣品(B)的HPLC圖譜

2.2 標準曲線方程

線性回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限及定量限結果見表2。

表2 8種對照品的線性方程、線性范圍、檢出限及定量限

2.3 精密度

取同一混合對照品溶液10 μL,按1.2.3項下色譜條件連續進樣6次,通過各對照品得到的峰面積來計算RSD(相對標準偏差),以此考察儀器的精密度。由表3可知RSD均小于2%,表明該方法精密度良好。

表3 精密度實驗結果

2.4 重復性

精密稱取同一小根蒜鱗莖樣品6份(S10),每份0.5 g,按1.2.2項下方法平行制備供試品溶液及按1.2.3項下色譜條件進行分析,分別進樣10 μL。記錄各核苷峰面積并計算其RSD,由表4可知RSD均小于3%,表明此方法重復性良好。

表4 重復性實驗結果

2.5 穩定性

取同一供試品溶液(S10)在室溫條件下密閉放置,于0、4、8、12、16、20 h進行分別測定尿嘧啶、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷,記錄各核苷峰面積并計算其RSD,由表5可知RSD均小于3%,表明供試品溶液在20 h內穩定性良好。

表5 穩定性實驗結果

2.6 加樣回收率實驗

稱取已知含量的小根蒜鱗莖粉末約0.25 g(S10),共6份,分別精密依次加入1.2.1項下各核苷對照品貯備溶液適量,按1.2.2項下方法制備供試品溶液,在1.2.3項下色譜條件下進樣,計算各成分的加樣回收率和RSD,在驗證本方法的準確性,計算加樣回收率,結果見表6。結果表明,小根蒜(S10)中8種堿基和核苷的平均回收率在97.72%～100.29%,RSD為1.44%～2.97%,符合分析要求。表明該方法的準確度較高,能應用于小根蒜中8種堿基和核苷的檢測與分析。

表6 小根蒜中8種堿基和核苷的加樣回收率實驗(n=6)

2.7 樣品含量測定

不同產地、不同部位小根蒜中8種堿基和核苷的含量結果見表7。結果表明:不同產地、不同部位小根蒜中核苷類成分較類似,均含有尿嘧啶、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷,不同產地小根蒜中8種堿基和核苷類成分的含量均存在較大的差異,但各核苷類成分無論是含量還是各成分的比例并沒有明顯的規律,這與潘興嬌等[17]對云南重樓中核苷類成分的研究結果相一致。以核苷總量為評價指標,重慶市大足縣(S3)、江西省撫州市(S8)、湖南省懷化市(S9)、安徽省績溪縣(S11)含量較高,與劉紅等[14-15]的報道結果相一致,是否與生態環境、種質資源、田間管理等有關[15-16],有待進一步深入研究。因此,進行小根蒜規模化栽培時,栽培基地的選擇對小根蒜的品質形成具有重大影響,本研究結果將對小根蒜的栽培基地選擇具有一定的參考意義。同時,尿苷、鳥苷、腺苷為其核苷類物質的主要成分,其含量遠遠高于其他核苷類物質,胸苷和2′-脫氧腺苷含量次之,尿嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤含量最少,這與小根蒜[13]、薤(藠頭)[15]的水溶性成分的研究結果一致。

表7 不同產地、不同部位小根蒜中8種成分的含量(μg·g-1,n=3)

由表7還可知,須根、莖、葉中8種堿基和核苷平均總含量超過鱗莖,同一產地不同部位的8種堿基和核苷總量部分超過傳統入藥部位(食用部位),特別是莖、葉生物量較大,提示這些部位均可作為核苷提取物的制備原料。但《中國藥典》(2015年版)規定薤白采收時除去須根,從核苷類成分的相對含量來看是否合理,值得進一步商榷[3]。

2.8 聚類分析

分別取14批小根蒜鱗莖的含量測定結果進行聚類分析。以表8中小根蒜鱗莖中尿嘧啶、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧腺苷及總含量為依據,通過SPSS23.0版本軟件歐式距離平方(squared Euclidean distance)計算樣品間的相似系數,并用離差平方和法(Ward法)進行系統聚類,結果見圖2。

圖2 HPLC法同時測定小根蒜鱗莖中8種堿基和核苷類成分含量的聚類分析樹狀圖

由圖2可知,當分類距離為22時,可將14批小根蒜鱗莖分為2類:第一類有11批樣品,即S1、S3-S5、S8-S14,此枝干樣品中8種堿基和核苷總含量均數均高于小根蒜鱗莖中的平均值;第二類有3批樣品,即S2、S6、S7,此枝干樣品中8種堿基和核苷成分總含量均數遠低于平均值。結果見表8。

表8 不同產地小根蒜鱗莖中8種堿基和核苷類成分含量聚類分析的不同組別各組分的平均含量(μg/g)

2.9 核苷的主成分分析

應用SPSS 23.0統計分析軟件對不同產地小根蒜8種堿基和核苷成分含量進行主成分分析。結果見表9，本文采取特征根大于1為提取標準,因此得到2個主成分,且兩個主成分的累積貢獻率為78.73%。第3個主成分特征根雖然小于1,但前3個主成分的累計貢獻率可達到89.63%,因此根據主成分的選取原則,可以選取前3個主成分代替原始指標進行分析。其中,第1主成分特征根λ=4.195,方差貢獻率為52.44%,貢獻率最大,包含的信息量大。第2主成分λ=2.103,方差貢獻率為26.29%。第3主成分λ=0.872,方差貢獻率為10.90%。3個主成分載荷圖見圖3。

表9 不同產地小根蒜鱗莖中8種堿基和核苷綜合評價

圖3 不同產地小根蒜鱗莖中主成分載荷圖

將SPSS 23.0軟件給出的因子負荷除以主成分相對應的特征根的平方根,便得到3個主成分中每個指標所對應的系數,表達式如下:C1=0.334X尿嘧啶+0.380X鳥嘌呤+0.261X尿苷+0.425X腺嘌呤+0.193X鳥苷+0.453X胸苷+0.199X腺苷+0.461X 2′-脫氧腺苷;C2=-0.340X尿嘧啶-0.086X鳥嘌呤+0.323X尿苷-0.160X腺嘌呤+0.604X鳥苷-0.082X胸苷+0.594X腺苷-0.148X 2′-脫氧腺苷;C3=0.352X尿嘧啶-0.484X鳥嘌呤-0.669X尿苷+0.154X腺嘌呤+0.267X鳥苷+0.122X胸苷+0.289X腺苷+0.025X 2′-脫氧腺苷。第1主成分C1與8個堿基和核苷類成分都呈正相關,其中與胸苷、2′-脫氧腺苷的正相關性較強。且3個主成分中,第1主成分貢獻率最大,說明胸苷、2′-脫氧腺苷2個成分在小根蒜鱗莖中核苷類的質量控制方面起著重要作用。

將小根蒜鱗莖每種核苷類測的含量進行標準化,再將標準化后的值放入到3個主成分(C1、C2、C3)方程中計算,得到樣品主成分得分。然后構建綜合評價函數(F):Fj=ω1C1+ω2C2+ω3C3。式中C1、C2、C3為前三個主成分得分;ω1、ω2、ω3分別為前三個主成分信息貢獻率。綜合得分見表9。

由表9可知,來自相同省區的不同產地小根蒜(鱗莖)中8種堿基和核苷的綜合評價也有顯著差異,如重慶市萬州區(S1)綜合評價排名第1,重慶市大足區(S3)綜合評價排名第3,而重慶市忠縣綜合評價排名第12。進一步表明小根蒜的品質表現出一定的地域和生境依賴性。

3 結論

本實驗首次建立了同時測定不同產地、不同部位小根蒜中8種堿基和核苷類成分含量的HPLC法,所建立方法能使不同樣品中8個指標成分均能得到良好分離,并且利用聚類分析和主成分分析方法對各地區小根蒜中含堿基和核苷的量給出了評價,為后期的質量評價及不同產地、不同部位的樣品分析提供一種可靠有效的手段。結果表明，38份不同產地、不同部位小根蒜中8種堿基和核苷類成分含量在線性范圍內的線性關系良好(r>0.9995)，檢出限為10.78～37.62 ng·mL-1，定量限為35.81～115.28 ng·mL-1及平均回收率為97.72%～100.29%，RSD<3%。小根蒜不同部位均可檢測到8種堿基和核苷類成分，且不同產地、不同部位小根蒜中8種堿基和核苷類成分的質量分數及組成結構比存在明顯的差異，部分非入藥、食用部位堿基和核苷含量高于其鱗莖。采用聚類分析能將不同產地的14份小根蒜鱗莖分為2類，且主成分分析法篩選出重慶市萬州區質量的綜合評價最好。本實驗測定結果為小根蒜的高效合理利用提供了理論依據。