利用氣相色譜法分析不同萃取方法對魚油中EPA、DHA含量的影響

李 林,黃萍萍,李華敏,王亞萍,倪娓娓

(1.煙臺市糧油質量檢測中心，山東煙臺 264001;2.魯東大學食品工程學院，山東煙臺 264025)

二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是魚油的特征脂肪酸,具有促進大腦發育、預防心腦血管疾病和消炎等多種重要的生理活性[1-4],建立高效準確的EPA和DHA含量的快速檢測方法，對于評價魚油產品質量、指導魚油生產企業改進制備工藝具有重要意義。目前,EPA、DHA含量檢測最普遍和準確的方法是氣相色譜法[5-9],我國還專門制訂了利用氣相色譜法檢測油脂中脂肪酸含量的國家標準GB5009.168-2016,具有準確率高、重現性好、各類脂肪酸物質分離度高的特點,但該法分析時間長,且其主要作用是用于分析C4～C22多種脂肪酸的含量,并未針對EPA、DHA的含量做單獨說明。基于上述問題,本文在脂肪酸國標定量分析方法基礎上,結合近年來國內外脂肪酸定量分析方法的研究成果,對黃鮫魚內臟油脂中的定量分析方法進行了探究,以期獲得快速、準確、重現性好的EPA、DHA氣相色譜快速定量分析方法,并利用該法研究了不同萃取方法[10-16]對魚油產品中EPA、DHA含量的影響規律,不僅為魚油品質測評提供了新的氣相色譜檢測條件,還客觀評價了不同萃取方法對魚油品質的影響規律,為魚油生產企業和相關研究工作者提供了新依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃鮫魚魚胃 煙臺海和食品有限公司;異辛烷(分析純)、甲醇(分析純)、氫氧化鉀(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)、硫酸氫鈉(分析純) 天津科密歐化學試劑有限公司;EPA甲酯、DHA甲酯標準品,純度>99% Sigma公司。

氣相色譜儀、色譜柱(Rtx-5,30 m×25 mm) 島津國際貿易有限公司;超聲強化亞臨界水設備(實驗室自制)、超臨界CO2萃取設備(HA220-50-06型) 杭州華黎泵業有限公司;DRHH-S4三列四孔恒溫水浴鍋 上海雙捷實驗設備有限公司;LT3002E電子天平 常熟市天量儀器有限責任公司;PS-10A超聲波 潔康牌;RE-52系列旋轉蒸發器、SHZ-Ⅲ型循環水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;DHG-9076A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海驚宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚油樣品的制備 以新鮮的黃鮫魚魚胃為原料,清洗、去雜質后,切成直徑1 cm左右的顆粒,冷凍干燥(冷阱溫度：-60 ℃，真空度：0.1 Pa,干燥時間24 h)后,放入密封盒內凍藏備用,分別利用超聲強化亞臨界水[11]、超聲波輔助溶劑[12]、中性蛋白酶水解[15]和超臨界CO2法[5,16]萃取黃鮫魚魚胃中的魚油,萃取條件參考相關文獻并結合實驗情況,對各萃取方法的萃取溫度和萃取時間進行了調整,具體萃取條件參數是:超聲強化亞臨界水(20 kHz,250 W,280 ℃,5022 kPa,60 min);超聲波輔助溶劑(20 kHz,500 W,25 ℃,正己烷提取30 min);酶解(中性蛋白酶,加酶量1%(w/w),30 ℃,振蕩提取5 h);超臨界CO2(30 MPa,65 ℃,5 h,流體流速3 mL/min)。

1.2.2 魚油脂肪酸甲酯化 參照國標GB/T 17376-2008脂肪酸甲酯的制備。

1.2.3 氣相色譜分析條件 色譜柱:色譜柱(Rtx-5,30×0.25 mm,0.25 μm);進樣器溫度300 ℃;FID檢測器溫度320 ℃;燃燒氣氫氣流量30 mL/min;空氣流量300 mL/min;進樣量1 μL;以氮氣為載氣。通過改變升溫程序溫度、分流比等參數,得到分析魚油樣品中EPA、DHA的最佳參數條件。

1.2.4 目標峰與其相鄰峰分離度的計算 分離度又稱分辨率,表示相鄰兩峰的分離程度,用R表示。R越大,表明相鄰兩組分分離越好。當R<1時,表明相鄰兩峰有部分重疊;當R=1.0時,表明相鄰兩峰基本分離;當R=1.5時,表明相鄰兩峰已完全分離。R等于相鄰色譜峰保留時間之差與兩色譜峰峰寬均值之比,計算公式如下:

R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)

式(1)

式中:tR2-相鄰兩峰中后一峰的保留時間;tR1-相鄰兩峰中前一峰的保留時間;W1、W2-相鄰兩峰的峰寬。

1.2.5 升溫程序對EPA、DHA色譜峰分離度的影響 色譜柱的可承受溫度范圍為330～350 ℃,而魚油中大部分脂肪酸在240～260 ℃即可揮發,但為防止少數未揮發物質污染色譜柱,使色譜柱溫度升至300 ℃。以超聲波輔助溶劑萃取獲得的魚油作為分析樣品,分流比10∶1條件下,考察不同升溫程序對EPA、DHA色譜峰及其相鄰峰分離度的影響,見表1。

1.2.6 分流比對EPA、DHA色譜峰分離度的影響 本實驗采用毛細管色譜柱,為了防止毛細管柱超載,須采用分流模式進樣,在進樣量為1 μL,采用升溫程序Ⅳ的條件下,以超聲波輔助溶劑萃取獲得的魚油作為分析樣品,分別考察分流比5∶1(Ⅰ)、10∶1(Ⅱ)、15∶1(Ⅲ)、20∶1(Ⅳ)對EPA、DHA與其相鄰峰分離度的影響。

1.2.7 不同萃取方法獲得魚油的EPA、DHA定量分析 用異辛烷稀釋EPA、DHA標準品成適當濃度,做GC分析,分析條件采用目標峰分離度最大時的色譜柱升溫程序和進樣分流比,根據色譜分析結果,分別確定EPA、DHA色譜峰的保留時間,并將不同濃度的EPA、DHA標準品溶液的濃度與對應色譜峰峰面積做標準曲線,獲得標準方程,利用外標法定量分析超聲強化亞臨界水、超聲波輔助溶劑、中性蛋白酶水解和超臨界CO2法萃取獲得魚油樣品中的EPA和DHA。計算公式如下:

C樣品=(V溶劑×C0×Ax)/(A0×Mx)

式(2)

式中:C樣品-魚油樣品中目標物質(EPA/DHA)的濃度(mg/g);V溶劑-魚油樣品甲酯化后的溶劑體積(mL);C0-標準品(EPA/DHA)的濃度(mg/mL);Ax-魚油樣品中目標物質(EPA/DHA)對應色譜峰的峰面積;A0-標準品(EPA/DHA)對應色譜峰的峰面積;Mx-魚油樣品的質量(g)。

1.2.8 實驗數據的統計學分析 實驗獲得數據均為三次平行測定數據的算術平均值,利用Excel 2013軟件進行數據的誤差分析,并采用鄧肯多重比較法(Duncan’smultiple range test)對數據進行顯著性差異分析。

2 結果與討論

2.1 升溫程序對EPA、DHA色譜峰分離度的影響

色譜柱升溫程序的建立依據是:魚油樣品內脂肪酸甲酯及目標物質EPA、DHA甲酯的沸點、色譜柱的最高使用溫度范圍及目標物質色譜峰與其相鄰峰的分離效果。色譜柱升溫程序對目標峰分離度的影響見圖1和表2。

圖1 色譜柱升溫程序對目標峰分離度的影響

表2 升溫程序對目標峰分離度的影響

在最佳色譜分析條件下,利用標準品色譜圖確定的EPA的出峰時間是10.015 min,DHA的出峰時間是16.500 min,由此確定魚油樣品色譜圖中出峰時間最接近的峰作為目標峰，進行分離度的計算,為便于觀察,各譜圖中EPA和DHA對應的色譜峰已用圓圈進行標注。改變升溫程序旨在通過改變色譜柱升溫速率以及在不同溫度范圍停留的時間達到促進脂肪酸物質相互分離、提高目標物質響應度和回收率的目的。升溫程序Ⅰ和Ⅱ雖然能夠實現對EPA(R1均>1.5)的快速分離檢測,但DHA的響應值很小，未能檢出。Ⅲ和Ⅳ均能檢出EPA和DHA,且響應值和分離度都能達到分析檢測要求,但在Ⅳ的條件下,EPA分離度更高,DHA的響應度更高,因此綜合考慮選擇升溫程序Ⅳ作為分析魚油中EPA、DHA的最佳分析條件。

2.2 分流比對EPA、DHA色譜峰分離度的影響

如圖2和表3所示,分流比對目標峰分離度有顯著影響(p=0.0375<0.05),四種分流比條件下,EPA的分離度均大于1.5,其中,分流比Ⅱ的R1最大,EPA的分離效果最佳。DHA的分子量較大,分子鏈更長,揮發性較低,不僅出峰時間晚,而且在溫度較低的條件下，響應值很低,是探索氣相色譜快速分析魚油組分的限制性成分。除分流比Ⅰ外,Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的R2均大于1.5,其中Ⅲ的R2最大,但綜合考慮DHA的響應度、峰面積百分比等分析效果,確定的最佳分流比條件是Ⅱ。

圖2 分流比對目標峰分離度的影響

表3 分流比對EPA、DHA色譜峰分離度的影響

2.3 不同萃取方法對魚油中EPA、DHA含量的影響

不同萃取方法分離富集魚油的原理不同、條件不同,也就意味著獲得魚油的萃取率和魚油內的主要生理活性組分EPA、DHA的含量有所差別。如圖3和表4所示,超聲強化亞臨界水對魚油的萃取率最高,達到13.97%,魚油中的EPA、DHA含量相較于其它三種方法最高,分別達到54.67 mg/g和134.01 mg/g。這是因為超聲波在亞臨界水內產生的物理效應聯合亞臨界水的水熱液化效應，對魚胃組織構造的破壞程度最大,魚胃基質蛋白發生水解,空間網格結構遭到徹底破壞,原本束縛在網格內的魚油液滴得以充分釋放到亞臨界水中,被充分溶解富集。酶解法的魚油萃取率和活性物質含量僅次于超聲強化亞臨界水,這是蛋白酶水解破壞基質蛋白肽鍵的結果,但其酶解時間較長,酶活性難以維持在活躍水平。超聲輔助溶劑萃取和超臨界CO2的魚油萃取率較低,這兩種傳統技術未能有效破壞魚胃顆粒的組織構造,萃取效率完全取決于溶劑對魚胃顆粒的滲透性及對目標物質的溶解性。

表4 不同提取方法獲得魚油的萃取率及活性物質含量

圖3 不同萃取方法獲得魚油的氣相色譜圖

文中所有實驗數據均為三次平行測定數據的平均值。利用Excel對數據進行方差分析，獲得每組數據的平方和SS、均方MS、F值、p值、根據p值大小可知，相對標準偏差RSD<5%考察的色譜柱升溫程序(p=0.0193<0.05)、進樣分流比對目標物質色譜峰分離度有顯著影響(p=0.0375<0.05),不同萃取方法對魚油樣品中EPA、DHA的含量會產生極顯著影響(p=9.5e-5<0.01)。

3 結論

色譜柱升溫程序和進樣分流比對魚油中EPA、DHA目標色譜峰的分離度有顯著影響(p<0.05),實驗確定的最佳GC分析條件是:色譜柱(Rtx-5,30×0.25 mm,0.25 μm);進樣器溫度300 ℃;FID檢測器溫度320 ℃;燃燒氣氫氣流量30 mL/min;空氣流量300 mL/min;進樣量1 μL,分流比10∶1;色譜柱升溫程序:初始溫度100 ℃,保持 2 min;以100 ℃/min升溫至230 ℃,保持2 min;以10 ℃/min升溫至240 ℃,保持4 min;以5 ℃/min升溫至250 ℃,保持1 min;以5 ℃/min升溫至260 ℃,保持2 min;以40 ℃/min升溫至300 ℃。在該分析條件下,得到的EPA的出峰時間是10.015 min,DHA的出峰時間是16.500 min。該法與國標GB5009.168-2016中的脂肪酸色譜分析方法相比,具有針對性強(可快速檢測EPA、DHA)、準確性高、重現性好和快速高效的特點,樣品分析時間由82 min縮短至18 min。在最佳分析條件下,超聲強化亞臨界水萃取法、超聲波輔助溶劑萃取法、酶解提取法和超臨界CO2萃取法獲得魚油中含有的EPA的檢出量依次是54.67、35.23、40.13、33.40 mg/g,DHA的檢出量依次是134.01、77.50、102.30、67.31 mg/g。