基于HS-SPME-GC-MS法優化醬牛肉中揮發性風味物質萃取條件

李 娟,韓 東,米 思,李 俠,張春暉

(中國農業科學院農產品加工研究所/農業部農產品加工綜合性重點實驗室,北京 100193)

醬牛肉是我國傳統醬鹵肉制品中的特色產品,其香味濃郁,口感豐厚,受到廣大消費者的喜愛和推崇[1]。醬牛肉是將牛肉預煮后,用肉桂、丁香、黃醬、料酒等香辛料和調味料煮制的肉制品,因其配料和加工方式不同,使醬牛肉具有不同的風味。風味是評價醬牛肉品質的重要指標之一,同時也是消費者購買產品的重要依據。風味的形成是由于加工過程中美拉德反應、脂肪氧化降解、硫胺素熱降解等共同作用的結果[2]。近年來,對醬牛肉中風味物質的相關研究有大量文獻報道,主要集中在醬牛肉風味物質不同分析方法的對比[3-4]、醬牛肉加工過程中風味物質含量變化[4-5]、醬牛肉風味物質形成等方面[6-7]。對于醬牛肉揮發性風味物質萃取條件優化方面研究較少。

目前,風味物質提取方法多采用同時蒸餾萃取法、微波輔助萃取法[8]、溶劑輔助蒸發法[9]、熱脫附法[10]、固相微萃取法等。固相微萃取(solid phase micro-extraction,SPME)作為一種集吸附、濃縮、進樣為一體的無溶劑樣品前處理方法,被廣泛應用于食品、醫藥及環境等領域,具有操作方便,樣品用量少,靈敏度高等特點[11]。對于肉制品的風味物質前處理,Ma等人[12]運用SPME-GC-MS進行了煮制牛肉中風味物質的提取和鑒定,得到24種風味成分;郭青雅等人[13]對羊肉臊子的風味物質進行了研究,用SPME法提取后,確定了35種氣味化合物;Corral等人[14]采用SPME-GC-MS技術研究了發酵香腸中的風味物質,共檢出95種化合物;Iglesias等人[15]用SPME-GC-MS技術對氧化魚肉中的揮發性風味物質進行了研究,共鑒定出79種化合物。故本文運用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜(Headspace solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)聯用技術研究醬牛肉中揮發性風味物質,對固相微萃取法進行條件優化,建立醬牛肉揮發性風味物質測定的最佳分析方法,初步確定醬牛肉中重要的風味物質,以期為今后醬牛肉風味品質調控提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

稻香村醬牛肉(真空包裝,300 g) 北京稻香村專賣店,保質期為90 d,主要配料有牛肉、黃醬、香辛料、醬油、白酒、大豆分離蛋白等。

QP 2010 Plus型氣相色譜質譜聯用儀 日本島津公司;100 μm 聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基苯(polydimethylsiloxane/divinylbenzene,PDMS/DVB)、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS)、自動SPME進樣器 美國Supelco公司;Waring SS110實驗室組織搗碎機 上海默西科學儀器有限公司;20 mL頂空進樣瓶 寧波哈邁儀器科技有限公司;賽多利斯BSA423S電子天平 賽多利斯(中國)有限公司;YC-300L低溫冷藏柜 中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 剔除醬牛肉表面凍鹵、可見筋腱,將剩余醬牛肉用組織搗碎機搗碎至顆粒狀。之后稱取一定量樣品置于20 mL頂空進樣瓶,旋緊瓶蓋。在分析測定前,放于4 ℃低溫冷藏柜中備用。

1.2.2 氣相色譜質譜條件 SPME條件:萃取頭在使用前,應在GC進樣口老化相應時間(100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB萃取頭分別在250 ℃老化0.5 h,50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在270 ℃老化0.5 h)。取出裝醬牛肉的20 mL頂空進樣瓶,將老化完成的萃取頭插入進樣瓶,預熱20 min后在一定溫度條件下吸附一定時間,解析2 min后,進行GC-MS分析。

GC條件:DB-WAX型毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣為He,流速1.6 mL/min;分流進樣,分流比為2∶1;采用程序升溫,具體為:初始溫度40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min上升到120 ℃,再以10 ℃/min升溫至200 ℃,保持33 min。

MS條件:電離方式:EI,電離電壓70 eV,離子源溫度200 ℃,掃描方式為全掃描,掃描范圍m/z 35～500。

1.2.3 萃取頭篩選實驗 稱取3.0 g樣品,預熱20 min,在60 ℃條件下吸附40 min,后在230 ℃解析2 min,考察 100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭對醬牛肉揮發性風味物質萃取效果的影響。

1.2.4 單因素實驗 依據有關文獻的報道[16-21],單因素實驗中選取萃取溫度、萃取時間、解析溫度、樣品質量為實驗因素,進行相應條件優化,以研究其對總峰面積、風味物質種類的影響。

在保持萃取時間為40 min,解析溫度為230 ℃,樣品質量3.0 g,及其他條件不變的情況下,分別選取萃取溫度為50、60、70、80、90 ℃進行優化,以選取合適萃取溫度。

在保持萃取溫度為60 ℃,解析溫度為230 ℃,樣品質量3.0 g時,及其他條件不變的情況下,分別進行萃取時間30、35、40、45、50 min的頂空固相微萃取實驗,以選取合適萃取時間。

在保持萃取溫度為60 ℃,萃取時間為40 min,樣品質量3.0 g,及其他條件不變的情況下,分別進行解析溫度200、210、220、230、240 ℃的頂空固相微萃取實驗,以選取合適解析溫度。

在保持萃取溫度為60 ℃,萃取時間為40 min,解析溫度為230 ℃,及其他條件不變的情況下,分別選取樣品質量為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g進行優化,以選取合適樣品質量。

1.2.5 響應面優化實驗 在單因素實驗基礎上,應用Box-Behnken中心組合實驗設計原理,以總峰面積作為響應值,進行四因素三水平響應面實驗,確定HS-SPME-GC-MS分析醬牛肉風味物質的最佳條件。實驗因素及水平見表1。

表1 響應面實驗因素水平表

1.3 定性定量方法

醬牛肉揮發性風味物質通過氣相色譜分離,后經質譜分析鑒定,得到總離子色譜圖。利用計算機檢索并與NIST11質譜庫進行匹配作初步分析,再結合人工譜圖解析,確定化合物,完成定性分析;按峰面積歸一法對揮發性風味物質進行定量分析。

1.4 數據處理

采用SPSS 20.0軟件對單因素實驗進行分析;利用Design-Expert 8. 0. 5b軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 萃取頭的確定

由表2可知,在相同條件下,65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭分別鑒定出33、32種化合物,而100 μm PDMS萃取頭僅分離得到13種化合物;與其他兩種萃取頭相比,65 μm PDMS/DVB萃取頭有較大總峰面積,故萃取頭選取65 μm PDMS/DVB。

表2 不同萃取頭對揮發性風味物質萃取效果的影響

2.2 單因素實驗

2.2.1 萃取溫度對萃取效果的影響 萃取溫度對風味物質的萃取效果有很大影響。其影響通過樣品在三相間的擴散系數和分配系數來實現。升高萃取溫度時,樣品中分子運動加快,隨之擴散速率會加快,即擴散系數增大;萃取溫度過高時,使萃取頭固定相發生解析,從而降低樣品中分子吸附,使分配系數減小[22]。由圖1可知,隨著萃取溫度的升高,總峰面積先增大后減小,70 ℃時總峰面積達到最大,而風味物質種類隨著萃取溫度的升高略有減少。總峰面積、風味物質種類在70 ℃后下降,可能是不易揮發的大分子物質吸附在萃取頭上,使揮發性小分子物質很難吸附上去,從而使總峰面積、風味物質種類下降[23]。綜上,選取70 ℃作為萃取溫度進行下一步實驗。

圖1 萃取溫度對揮發性風味物質萃取效果的影響

2.2.2 萃取時間對萃取效果的影響 萃取時間對萃取頭的吸附量和萃取效果有較為重要的影響。SPME是一種基于樣品揮發性風味物質在頂空與萃取頭薄膜上的動態分配平衡過程,而萃取時間即為萃取達到平衡時所需要的時間,一般萃取過程均在剛開始時吸附量迅速增加,到一定的點位后上升就很緩慢[24-25]。由圖2可知,萃取時間為30～50 min時,風味物質種類和總峰面積呈現先增加后下降的趨勢,其中,45 min時,風味物質種類最多。但在40～45 min時,總峰面積變化不顯著(p>0.05),基本趨于平穩,說明萃取頭在45 min便能達到飽和。通過分析色譜圖發現,保留時間在40 min后,仍有一些主要風味物質出現,如果縮短萃取時間,將不利于這些物質的揮發和吸附,減少風味物質析出。因此,選取45 min作為萃取時間。

圖2 萃取時間對揮發性風味物質萃取效果的影響

2.2.3 解析溫度對萃取效果的影響 解析溫度對固相微萃取時的解析時間和萃取效果有較大的影響,結果如圖3所示。若解析溫度過低,則有可能因解析不完全,導致下一次的吸附誤差;若解析溫度過高,會使萃取頭涂層脫落,增加含硅物質的大量析出,并有可能使一些吸附的風味物質發生氧化等[26-27]。由圖3可知,解析溫度為200～210 ℃時,隨著解析溫度的增大,總峰面積和風味物質種類減少,可能是210 ℃時萃取頭涂層中含硅物質析出,主要風味物質減少,總峰面積變小。解析溫度為210～230 ℃時,總峰面積、風味物質種類呈現不斷增加的趨勢,230 ℃達到最大值,之后隨著解析溫度增大,總峰面積和風味物質種類開始減小。故選取230 ℃為后續實驗的解析溫度。

圖3 解析溫度對揮發性風味物質萃取效果的影響

2.2.4 樣品質量對萃取效果的影響 樣品質量對萃取時間、萃取效果有較大影響,當樣品質量越大,萃取頭吸附物質越多,總峰面積越大;當樣品質量過多,會導致預熱時受熱不均勻,使物質不能很好地揮發,相應地會降低萃取效果[28]。由圖4可知,樣品質量為2.0 g時,總峰面積達到最大,風味物質種類也較多,隨后兩者均在減小,可能是萃取頭吸附出現飽和,不能萃取更多的風味物質[29]。故選取的樣品質量為2.0 g。

圖4 樣品質量對揮發性風味物質萃取效果的影響

2.3 響應面法優化分析

根據單因素實驗結果,以萃取溫度(A)、萃取時間(B)、解析溫度(C)、樣品質量(D)為影響因素,總峰面積作為響應變量,利用Design-Expert 8. 0. 5b軟件設計響應面實驗,結果見表3。

表3 響應面設計方案和結果

利用Design-Expert 8.0.5b軟件對實驗數據進行多元回歸分析,得到回歸方程:Y=3.98+4.32A+0.53B+0.85C+0.10D-0.33AB-0.19AD+0.21BC-0.08BD-0.12CD+2.53A2+0.90B2+0.27C2+0.84D2,其中各項系數的絕對值大小表示各因素對響應變量的影響程度。根據實驗數據進行響應面方差分析,結果見表4。

該擬合模型p值<0.0001,說明模型極顯著(p<0.01),表明實驗方法可行;失擬項不顯著(p=0.2472>0.05),說明回歸方程擬合度較好,實驗誤差比較小;其中決定系數R2=0.9590,表明回歸方程效果好,預測具有可靠性。由表4可知,回歸模型中一次項A、C和二次項A2對總峰面積的影響極顯著(p<0.01),說明二次項B2、D2對總峰面積的影響顯著(p<0.05)。從表4所列的F值大小可知,4個因素對總峰面積影響程度大小依次為:萃取溫度>解析溫度>萃取時間>樣品質量。

表4 方差分析結果

用Design-Expert 8.0.5b軟件繪制響應面圖,萃取溫度、萃取時間、解析溫度、樣品質量兩兩交互作用對響應值總峰面積的影響如圖5所示。從5圖中可知,其兩兩交互作用均不顯著。通過對回歸模型進行分析,得到固相微萃取的最適條件為:萃取溫度68.95 ℃,萃取時間46.51 min,解析溫度239.89 ℃,樣品質量1.68 g,在此條件下,預測總峰面積為1.44×108。考慮到實驗可行性和局限性,上述條件修改為:萃取溫度70 ℃,萃取時間45 min,解析溫度240 ℃,樣品質量2.0 g,得到總峰面積1.46×108,風味物質種類為44種,實際總峰面積與理論預測總峰面積相比,其相對誤差為1.37%,說明響應面法對萃取條件的優化具有可行性。

圖5 萃取溫度、萃取時間、解析溫度、樣品質量兩兩交互作用對萃取效果的影響

2.4 醬牛肉揮發性風味物質檢測

根據上述最佳萃取條件,對醬牛肉揮發性風味物質進行萃取,其HS-SPME-GC-MS色譜圖如圖6所示。揮發性風味物質種類及相對含量結果見表5。

圖6 醬牛肉揮發性風味物質總離子流圖

HS-SPME-GC-MS法檢測到的醬牛肉揮發性風味物質結果見表5,共檢測出44種揮發性風味物質,其中醛類9種(51.29%)、醇類8種(8.61%)、酮類4種(6.49%)、醚類2種(6.75%)、酯類6種(4.76%)、酸類4種(2.43%)、烴類2種(0.58%)、含氮含硫及雜環化合物9種(16.78%)。

表5 醬牛肉揮發性風味物質種類和相對含量

續表

醛類閾值大多較低,是肉類風味的主要成分之一,主要來源于脂肪的氧化降解和斯特雷克氨基酸反應[30]。醬牛肉中檢出的醛類物質有己醛、庚醛、壬醛、苯甲醛、大茴香醛、十六醛、肉豆蔻醛等,己醛是亞油酸的主要氧化產物[31],苯甲醛是苯丙氨酸降解產物[32],大茴香醛、肉豆蔻醛可能來源于八角茴香、小茴香等物質中。醇類來源于脂肪的氧化降解,其飽和醇由于閾值高,對醬牛肉風味貢獻較小,而不飽和醇由于閾值低,對風味貢獻較大[33];醬牛肉中檢出的桉葉油醇、4-萜烯醇、α-松油醇,具有樟腦般清涼香味、胡椒香味、丁香花味,是重要的風味貢獻物質。酮類是脂肪氧化降解的另一重要產物,對肉風味形成極為重要,其中3-羥基-2-丁酮具有令人愉快的奶香味[34]。

醚類主要來源于香辛料,檢出的茴香腦、草蒿腦可能來自于添加的八角茴香、小茴香、大茴香等物質,其賦予醬牛肉愉快的香氣和醇厚感[35-36]。酯類、酸類是脂肪酸和醇縮合、脂肪氧化降解形成的,由于閾值較高,因此對醬牛肉風味貢獻不大,但它們是一些雜環化合物形成的重要中間體,具有不可忽視的基底作用[37]。烴類主要來源于脂肪酸烷氧基的均裂和脂肪降解,分為飽和烴和不飽和烴,飽和烴閾值較高,對風味影響不大,不飽和烴閾值較低,對風味影響較大;如醬牛肉中檢出了不飽和烴甲苯[38]。含氮含硫及雜環化合物閾值較低,是肉品中最重要的風味物質,主要通過美拉德反應,氨基酸和硫胺素熱解生成;其呋喃類物質是最豐富的美拉德反應產物,如醬牛肉中檢出的2-戊基呋喃、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮,具有肉品的烘烤味和堅果味[39-40]。

3 結論

本實驗基于HS-SPME-GC-MS方法,對北京稻香村醬牛肉中的揮發性風味物質的萃取條件進行了優化并對其揮發性風味物質進行了研究。通過優化,頂空固相微萃取的條件為:選取65 μm PDMS/DVB萃取頭,在樣品質量2.0 g,萃取溫度70 ℃,萃取時間45 min,解析溫度240 ℃,解析時間為2 min時,萃取效果較好,得到總峰面積1.46×108,風味物質種類為44種,實際總峰面積與理論預測總峰面積相比,其相對誤差為1.37%,說明響應面法對萃取條件的優化具有可行性。共檢測到醛類、醇類、酮類、醚類、酯類、酸類、烴類、含氮含硫及雜環化合物8類物質,其中醛類、含氮含硫及雜環化合物的相對含量較高,分別為51.29%±2.80%和16.78%±1.10%,且閾值低,是北京稻香村醬牛肉中主要的揮發性風味物質,對其風味貢獻較大。