DKK1對AGEs/TNF?α微環境牙周膜干細胞骨向分化能力的影響*

楊 琨，李 駿，豐奇昊，沈夢杰，陳謙謙，羅雅馨，劉 琪△（遵義醫科大學附屬口腔醫院：.牙周科；.種植科，貴州遵義563000）

牙周炎作為全球性普遍發生的慢性炎性反應，能夠導致牙齦、牙槽骨、牙骨質的牙周組織損傷，最終使牙齒出現松動及缺失[1]。牙周膜干細胞（PDLSCs）作為間充質干細胞（MSC）的一個特殊群體，目前已成為牙周組織缺損修復的重點研究對象[2]。研究表明，慢性牙周炎中獲得的PDLSCs再生潛能會受到損傷[3]。對糖尿病伴牙周炎患者而言，牙周炎的嚴重程度以糖尿病進程之間密切相關，且牙周炎已經被認為是糖尿病的第六大并發癥[4]。然而，目前研究中糖尿病伴牙周炎狀態下的PDLSCs的相關生物學特性還尚未探究明白。

在學者的努力研究下，牙周炎和糖尿病兩者相互關系正逐漸明朗。臨床研究發現，在糖尿病患者的糖基化終末產物（AGEs）水平與健康患者具有明顯差異[5]，且糖尿病患者中AGEs細胞膜受體的晚期糖基化終產物（RAGE）被配體AGEs激活，表達量升高。因此，在牙周炎及其他糖尿病并發癥中，AGEs逐漸受到學者們的重視[6-8]。另有研究發現，抑制糖尿病小鼠的RAGE通路能夠降低牙周炎相關骨吸收，還能降低牙齦組織中促炎性細胞因子的產生[9]。而提高RAGE的表達量，則會導致糖尿病患者牙周組織中炎性反應及組織損傷加劇，最終加速牙周的破壞[10-11]。此外，AGEs還能夠通過抑制MSC的成熟，弱化MSC的分化能力從而阻止組織修復[12]，但是目前學者對AGEs-RAGE軸的整個機制仍然知之甚少。

DKK1作為Wnt通路的經典抑制劑，已廣泛應用于成骨分化的研究[13]，其通過與Wnt受體結合，影響下游信號轉導[14-15]。雖然有研究表明DKK1可以通過抑制Wnt/β-catenin通路從而抑制PDLSCs的成骨分化[16]，但本研究表明，在糖尿病伴牙周炎PDLSCs中的表達中，DKK1是被抑制的，而利用DKK1抑制Wnt通路則能調節RAGE的表達，逆轉D-PDLSCs造成的骨向分化能力減弱。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 α-MEM培養基、膠原酶、胰蛋白酶購于Gibco公司；胎牛血清購于四季青公司；鼠抗人CD44、CD146、stro-1、CD90、CD271、CD45 單克隆抗體購于Abcam公司；重組人DKK1購于Abcam公司；AGEs-牛血清清蛋白（BSA）購于Bio Vision公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）購于 Peprotech 公司；細胞總 RNA 提取試劑盒、一步法采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒購于Takara公司；蛋白質及IP細胞裂解液購于Beyotime公司；BCA蛋白定量試劑盒購于Beyotime公司；Runx2一抗購于Abcam公司；Osterix一抗購于Abcam公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）鼠單克隆抗體購于Abcam公司；羅丹明山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）購于中杉金橋公司；山羊抗兔lgG購于Abcam公司；體視顯微鏡、倒置相差顯微鏡及照相系統購于OLYMPUS公司；流式細胞分析儀購于Beckmen Coulter公司；real time PCR儀器購于Applied Biosystems。

1.2 方法

1.2.1 人牙周干細胞培養和分離及表面分子鑒定 （1）取材和培養。選取在遵義醫學院附屬口腔醫院就診，18～25歲正畸而需拔除前磨牙者作為牙周膜組織獲取主要對象。選擇標準為：①口內余留牙不少于20顆；②身體健康，不吸煙，無糖尿病病史及家族史，血糖水平正常；③無消化、呼吸、生殖、泌尿等系統或身體其他部位的感染，無其他嚴重疾病。拔牙后生理鹽水反復沖洗第三磨牙3次，轉移至含有100 U/mL青霉素及鏈霉素0.1 mg/mL的α-MEM培養基中。磷酸緩沖鹽溶液（PBS）反復沖洗牙根3次，超凈臺刮取根中1/3牙周膜組織，Ⅰ型膠原酶消化，10%胎牛血清的α-MEM中和離心，37 ℃、5%CO2恒溫箱貼壁培養 PDLSCs。（2）流式細胞儀檢測相關表面分子。通過檢測 STRO-1、CD146、CD44、CD90、CD271、CD45 鑒定 PDLSCs。

1.2.2 RT-PCR 檢測 Runx2、堿性磷酸酶（ALP）mRNA表達 3組PDLSCs細胞成骨誘導培養7 d后進行細胞收集，按TRIzol說明書抽提各組細胞總RNA，并用逆轉錄試劑盒合成cDNA。參照GenBank數據庫，以Primer primer 5.0計算機軟件設計引物；以β-actin為內參照，采用 RT-PCR 檢測，反應體系為：premix 10 μL、dye 0.4 μL、ddH2O 6.6 μL、上下游引物各 0.5 μL、樣本模板2 μL；反應條件參照產品說明。試驗重復3次，所用引物均由上海生工公司合成，各引物基因序列見表1。

1.2.3 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測RUNX2及Osterix蛋白表達 取骨誘導14 d后的各組細胞，用Western及IP細胞裂解液進行總蛋白提取；用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量測定；十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE），轉膜，封閉，免疫反應；最后進行化學發光反應檢測各組RUNX2及Osterix蛋白的表達，用IPP 6.0軟件對其灰度值進行定量分析。

1.2.4 ALP活性和礦化結節形成量分析 誘導培養7 d，取各組細胞分別用ALP試劑盒對各組細胞進行染色；28 d取各組細胞進行茜素紅染色。

1.3 統計學處理 使用SPSS 11.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水平值α=0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PDLSCs原代培養與傳代培養 見圖1。

2.2 PDLSCs表面標志物檢測 流式細胞儀檢測第三代 PDLSCs表面標志物 STRO-1、CD146、CD44、CD90、CD271（CD271/P75NTR已作為MSC來源的細胞表面標志物）[17]，其陽性率分別為 12.4%、57.7%、99.1%、95.8%、8.46%，CD45為陰性表達。

表1 引物基因序列

圖1 PDLSCs原代培養與傳代培養圖

2.3 PDLSCs成骨能力受損情況 ALP與茜素紅染色表明，與PDLSCs組比較，AT-PDLSCs組成骨能力明顯降低。見圖2。

圖2 各組ALP染色及茜素紅染色圖

2.4 DKK1逆轉 AGEs/TNF-α對 PDLSCs成骨的影響 RT-PCR表明，D+AT-PDLSCs組骨向分化標志基因Runx2、ALP水平表達高于AT-PDLSCs組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。Western blotting檢測發現，D+ATPDLSCs組Runx2、Osterix水平表達也高于AT-PDLSCs組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 3、4。

圖3 RT-PCR檢測各組Runx2、ALP的mRNA表達量

圖4 Western blotting檢測各組Runx2、Osterix蛋白表達量

3 討 論

PDLSCs具有能再生牙周組織的干性。前期研究中已證實PDLSCs能夠在牙周缺損的治療中起重要作用[18-19]。本研究旨在探討糖尿病伴牙周炎微環境對PDLSCs成骨能力的影響。AGEs抑制了PDLSCs的成骨潛能，并且協同TNF-α產生糖尿病伴牙周炎炎性微環境，進一步抑制PDLSCs的成骨能力。

研究表明，PDLSCs能夠修復牙齒支持復合部件（牙周膜、牙槽骨、牙骨質）[20]，在牙周炎發生、發展過程中起重要作用。前期研究中，作者已證實炎性反應對PDLSCs的影響，作者希望探究單純牙周炎和全身疾病伴發的牙周炎對PDLSCs的影響是否一致。有學者研究表明，不同年齡來源的H-PDLSCs與P-PDLSCs特性不同[3，21]，并發現 DKK1 對 H-PDLSCs與 P-PDLSCs都存在相同的影響。DKK1可能逆轉P-PDLSCs受損的成骨潛能。

近年來，AGEs與糖尿病及其伴發性疾病的關系受到關注[7]，本課題組針對AGEs對PDLSCs生物學性能的影響也進行了大量研究[22-25]。然而，Wnt/β-catenin信號通路與多種疾病的發病機制相關。研究表明，Wnt信號是糖尿病的主要調節點[26-28]，但Wnt信號通路在糖尿病伴牙周炎發生、發展中的作用尚不清楚。本研究中，體外試驗表明DKK1可促進AT-PDLSCs成骨分化，而試驗中也能發現DKK1可促進H-PDLSCs的礦化。但該結果相對于其他試驗組缺少某些穩定性，這可能與微環境對PDLSCs克隆形成的影響有關。PDLSCs屬于MSC一類，研究表明Wnt/β-catenin信號通路能夠促進MSC的成骨分化[29-30]。也有研究表明，高水平的Wnt3a處理則會抑制MSC的成骨分化[31-32]。本課題組也發現，Wnt通路在骨髓來源MSC和牙周膜來源MSC的作用恰恰相反，在兩者中可能會出現不同的炎性反應影響[33]。Wnt3a和 LiCl能夠激活 Wnt/β-catenin 信號通路，抑制牙周組織來源MSC的成骨分化能力[34]。作者推測，這可能是由于PDLSCs是牙周組織中的另一種MSC，并且可能與不同克隆形成來源有關。因此，Wnt信號通路對MSC中成骨細胞分化能力是激活還是抑制尚待進一步研究。

綜上所述，AGEs/TNF-α模擬糖尿病伴牙周炎微環境的PDLSCs功能受損。Wnt信號通路抑制劑DKK1處理后表現出骨形成能力的提升，可能部分源于AGEs-RAGE軸的調控，相關機制可能涉及AGEs誘導的PDLSCs功能失調。目前研究的最終目的是修復糖尿病伴牙周炎的牙周組織缺損，而Wnt信號通路的調控能夠促進PDLSCs生物學性能，DKK1或者某些小分子化合物能夠促進PDLSCs骨向分化潛能，故可將其作為修復糖尿病伴牙周炎牙周缺損治療中的重要因子。