人類ARGONAUTE和DICER基因家族在結腸癌中的表達分析*

張成晨，劉莉娟，李楠，郭秀麗，章夢琦，肖娟，翟立紅△，龔文容（.湖北文理學院，湖北襄陽44053；.襄陽市中心醫院腫瘤科，湖北440）

結腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，全球各個地區的發病率存在明顯差異，但發病率和病死率排名均靠前。其在西歐、北美等發達國家中的發病率高于亞洲、非洲。近些年，我國結腸癌發病率已超過發達國家，這與人們的高脂肪飲食習慣有關[1]。結腸癌在發生和演變過程中受不同基因誘導調控，ARGONAUTE蛋白和DICER酶是RNA誘導沉默復合體（RISC）的主要組分，在RNA干擾中發揮重要作用。人類ARGONAUTE家族分成AGO亞家族和PIWIL亞家族，共有八大成員，分別為 AGO1、AGO2、AGO3、AGO4、PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4基因。人類DICER家族有2位成員分別為DICER和DROSHA蛋白。近年來，相關研究表明，ARGONAUTE家族和DICER家族在人類腫瘤發生、發展過程中均有密切聯系，可作為診斷腫瘤的新指標。本研究通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測分析AGO和DICER基因家族在正常結腸組織和癌組織中的表達情況，探討其與結腸癌的關系，初步探索ARGONAUTE和DICER基因家族在結腸癌發生、發展中的作用及其在臨床中的意義。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究選取襄陽市中心醫院腫瘤科術中結腸癌切除后即取配對的癌組織和癌旁組織，并經醫院倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑 RNA提取試劑盒（艾德萊），逆轉錄試劑盒（TOYOBO），SYBR green qPCR mix（艾德萊），熒光定量PCR儀（ABI）。

1.3 方法

1.3.1 結腸癌組織和癌旁組織的cDNA獲取 將取得的結腸癌組織和癌旁組織標本置于凍存管中，立即投入液氮中速凍，在液氮中保存。提取RNA時取約0.2 g凍存組織，按RNA提取試劑盒說明書提取組織總RNA，依據逆轉錄試劑盒說明書，將提取的RNA逆轉錄成 cDNA。RNA 熱變性：12 μL 體系，RNase Free H2O 8 μL，Oligo（dt）20 μL，Total RNA 3 μL。PCR 條 件 ：65℃、5 min，立即置于冰上；隨后在離心機離心：3 500 r/min、1 s。逆轉錄反應：20 μL 體系，第一步 RNA 變性溶液 12 μL，5×RT Buffer 4 μL，dNTP Mixture 2 μL，RNase Inhibitor 1 μL，ReverTra Ace 1 μL。PCR 條件：95 ℃、3 min，42 ℃、20 min，99 ℃、5 min，4 ℃、5 min。隨后在離心機離心：3 500 r/min、1 s。依據表1合成的引物檢測，cDNA轉錄成功。

表1 qPCR所用引物序列

1.3.2 ARGONAUTE和DICER基因家族的引物合成 在NCBI上搜索目的基因，找到目的基因的mRNA，選擇合適的編碼序列。用Primer Premier 5軟件將引物序列設計好并發送至上海生工生物工程技術服務有限公司合成。所用引物序列見表1。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測ago和DICER家族表達 應用96孔PCR板，qPCR反應體系共25 μL，溶解曲線條件為 95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、30 s，60℃，15 s。反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40個循環。根據公式 ΔΔCt=（結腸癌 CtAGO家族?結腸癌CtGAPDH/β-actin）?（癌旁組織 CtAGO家族?癌旁組織 CtGAPDH/β-actin），每個標本重復試驗3次，結果取平均值。

1.4 統計學處理 采用SPSS19.0統計學軟件分析。采用Mann-WhitneyU檢驗AGO和DICER家族在癌癥組織和癌旁組織中表達的差異。以P＜0.05為差異有統計學意義

2 結 果

結腸癌及癌旁組織中AGO亞家族表達的實時熒光定量PCR結果，見圖1。AGO2在結腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）；AGO1、AGO3、AGO4在結腸癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結腸癌及癌旁組織中PIWIL亞家族表達的實時熒光定量PCR結果，見圖2。PIWIL亞家族成員在結腸癌中的表達明顯低于癌旁組織，其中2種組織PIWIL1、PIWIL2表達比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結腸癌及癌旁組織中DICER家族表達的實時熒光定量PCR結果見圖3。DICER家族成員在結腸癌中的表達低于癌旁組織，DICER、DROSHA表達比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 2種組織中ARGONAUTE亞家族表達

圖2 2種組織中PIWI亞家族表達

圖3 2種組織中DICER家族表達

3 討 論

ARGONAUTE蛋白家族是一類高度保守的堿性蛋白，共同結構有PAZ結構域、MID結構域和PIWI結構域[2]。PAZ結構域和PIWI結構域形成特殊分子結構，建立了一個供底物結合的溝槽，有助于siRNA和目標mRNA結合，并可以剪切 mRNA[3]。AGO2蛋白結合DICER酶等組成了RISC，DICER酶剪切dsRNA形成的siRNA并入RISC，隨后高度特異性地結合并降解靶標基因mRNA。RISC在siRNAs或miRNAs引導的基因沉默過程中，通過AGO蛋白催化活性直接啟動靶mRNAs的降解[4]，這一過程是在RNAi中發揮重要作用的關鍵步驟。AGO2被發現在膀胱上皮癌[5]、頭頸部鱗狀細胞癌[6]、卵巢上皮癌中過度表達[7]。AGO2的過度表達已被證實與腫瘤細胞的生長、患者的總體生存率有關[8-9]。然而，也有報道稱，在黑素瘤中，AGO2的表達明顯降低[10]，通過基因操作過度表達AGO2則可以抑制細胞和腫瘤的生長[11-12]。AGO2在不同組織的不一致表達水平可以解釋為：由于不同的miRNAs表達模式，AGO2的表達水平會因癌癥類型不同而不同[13-14]。此外，AGO2還被發現與癌癥血管生成、轉移等有關。這些過程的調控機制也會因癌癥的類型和階段不同而不同。癌癥類型、癌癥分期、miRNAs的表達模式和腫瘤發育調節機制是AGO2表達和功能的主要影響因素。有研究表明，AGO2直接與某些惡性腫瘤的已知腫瘤因素相互作用，而miRNA卻不參與此過程。SHANE等[15]報道AKT3可以使在S387上的AGO2磷酸化，抑制AGO2與GW180結合進入P小體，從而抑制靶基因的表達。本試驗AGO2的表達和其他研究結果一致，結腸癌中AGO2的過度表達，可能與miRNA參與或結腸癌的癌癥因素作用有關，其上調表達背后的機制還需進一步研究闡明。

AGO1在人體組織中普遍表達，尤以皮膚中明顯表達。VERA等[16]從核層次證實核AGO1調節了AGO1結合基因的表達，這些基因參與了包括細胞周期進展、生長和存活在內的致癌途徑。研究發現，在黑素瘤細胞系中Mel Ei和Mel Ho細胞表現出最高的AGO1表達水平；在上皮結腸直腸癌細胞表現出AGO2的高表達和AGO1的低表達；在肝癌HepG2細胞表現出AGO1 mRNA高表達[17]。AGO3和AGO4在人體組織中都呈弱陽性表達，但AGO3、AGO4在某些惡性腫瘤中常發生缺失，暗示惡性腫瘤的發生、發展可能與AGO3和AGO4蛋白的低水平表達或沉默有關。本研究試驗結果顯示，AGO1、AGO3、AGO4均明顯表達下調，可能與所在染色體的丟失或siRNA對AGO蛋白的沉默有關。

PIWIL亞家族蛋白質主要在生殖細胞中表達，其功能是維持生殖干細胞和減數分裂，以及干細胞自我更新。腫瘤干細胞的形成是腫瘤發生的起始。PIWIL亞家族也與惡性腫瘤有關。在乳腺癌[18-19]、胃癌[20]、食管癌和子宮內膜癌中都檢測到PIWIL1的表達上調[21-22]。范正軍等[23]研究表明，PIWIL1在肝癌組織中高表達暗示患者預后不良。同樣，研究表明，在軟組織肉瘤和胰腺導管腺癌中，PIWIL1高表達提示患者的預后不良[24-25]，暗示這種關系也可能會出現在其他惡性腫瘤中。研究發現，PIWIL1在不同肝癌細胞系中上調或下調，其中的機制需要進一步研究[26]。PIWIL2在人體睪丸、卵巢、小腸、十二指腸組織中陽性表達，特別是在睪丸中明顯陽性表達。有研究發現，PIWIL2表達上調會導致精原細胞瘤發生。在早期宮頸癌和乳腺癌中[27-28]，PIWIL2表達上調且廣泛，可以作為診斷腫瘤的標志物。研究發現，在非小細胞肺癌（NSCLC）中PIWIL1和PIWIL2高表達，并且PIWIL1和PIWIL2表達與腫瘤增殖呈正相關[29-30]。PIWIL2在預后差的NSCLC中表達過量，因此，PIWIL2可以作為判斷NSCLC預后情況的1項指標。PIWIL3蛋白在人體睪丸中陽性表達，在其他組織中不表達，近期被發現在人星形細胞神經膠質瘤和腦脊膜瘤細胞質中表達。PIWIL4在人體組織中廣泛表達，其中以睪丸和骨髓組織中陽性表達明顯，但也在轉移性肺癌、胃癌等癌細胞中表達。研究發現，PIWIL4在乳腺癌中高表達，降低表達會影響癌細胞的遷移能力[31]。PIWIL亞族成員在本研究癌組織中均是表達下調。PIWIL1和PIWIL2在不同的癌組織中上調或下調，表明可能有未知的通道或miRNA影響PIWIL蛋白的表達。

miRNA與腫瘤的發生、發展密切相關，而miRNA由DICER和Drosha酶剪接生成，因此，DICER和Drosha的異常表達也與腫瘤的發生、發展有關。本研究中DICER和Drosha的表達下調，這與已知研究結果一致。曹政[32]研究發現，DICER和Drosha蛋白在骨肉瘤中表達呈高陽性表達，而在骨軟骨瘤中呈低陽性表達，且兩者在骨肉瘤和骨軟骨瘤中呈明顯正相關，提示其可能共用同一途徑發揮作用。現有文獻表明，DICER和Drosha在人子宮內膜癌、鼻咽癌、乳腺癌、神經母細胞瘤等大多數腫瘤中表達下調[33-36]。有研究對 Be2C、NMB7、NB5等3種神經母細胞瘤細胞系進行操作，沉默DICER或Drosha基因后顯示miR-17-5p和let-7a低表達，瘤細胞的增殖能力明顯增強[36]。研究表明，對肺癌、卵巢癌、結直腸癌患者而言，DICER和Drosha表達下調意味著其預后不良[37-39]。

本研究中，人類ARGONAUTE和DICER基因家族在結腸癌中均為異常表達，呈明顯上調或下調。在結腸癌中只有AGO2明顯上調。雖然AGO2的功能復雜，其在結腸癌的作用機制尚不十分清楚，但這為以后結腸癌的治療研究提供了方向，希望其可成為治療結腸癌的新分子靶點。其他AGO蛋白均為表達下調，多數只在特別的癌組織中被激活通道表達，但其參與結腸癌的過程還不清楚。DICER和Drosha在結腸癌中表達下調，表明患者預后不良，可以作為患者預后的一個新標志物。今后，還需要進一步研究其與特定miRNA的作用關系，為治療結腸癌提供新的分子靶點。