石斛總多糖提取工藝及測定方法研究

許磊

（天津民祥生物醫藥股份有限公司 天津 300000）

石斛為蘭科植物馬鞭石斛、鐵皮石斛、環草石斛、黃草石斛的新鮮或干燥莖，被稱為“九大仙草”之首，為珍稀、名貴、道地中草藥，當下多以其總多糖含量的高低來判斷石斛品質的優劣。本研究以總多糖含量為指標，通過正交實驗，優化并最終確定了石斛總多糖的最佳提取工藝，以期為石斛總多糖的提取工藝研究提供參考和借鑒。

1.材料與試劑

石斛采自安徽省霍山縣，無水葡糖糖、苯酚、硫酸等化學試劑均為分析級，實驗用水均為Milli-Q超純水機制備（密理博（上海）貿易有限公司）。紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；LC-4016型低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；十萬分之一天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；雙層鐵皮電爐（上海日用電爐廠）。

2.方法與結果

2.1 石斛中總多糖含量的測定

2.1.1 對照品溶液的制備

取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，于100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，制成每1mL含90μg/mL的溶液，即得對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取石斛粉末（過三號篩）約0.12g，精密稱定，加水80mL，加熱回流2小時，放冷，轉移至100mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液2mL，置15mL離心管中，精密加入無水乙醇10mL，搖勻，冷藏1h，取出，離心（轉速為每分鐘4000轉）20min，棄去上清液（必要時濾過），沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉移至25mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 總多糖含量的測定

精密量取供試品溶液1mL，置10mL具塞試管中，精密加入5% 苯酚溶液 1mL，搖勻，再精密加硫酸5mL，搖勻，置沸水浴中加熱20分鐘，取出，置冰浴中冷卻5分鐘，以相應試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（2015藥典通則0401），在488nm的波長處測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的量，計算，即得。

總多糖提取率=總多糖質量/原藥材的干品重量×100%。

2.1.4 標準曲線的制備

精密量取對照品溶液0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分別置10mL具塞試管中，各加水補至1.0mL，振搖，精密加入5%苯酚溶液l.0mL（現配現用，注意避光），搖勻，再精密加硫酸5mL，搖勻，置沸水浴中加熱20分鐘，取出，置冰水浴中冷卻5分鐘，以相應試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（2015藥典通則0401），在488nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。在9.016～90.160 μg/mL范圍內線性良好（y=0.00881x+0.11252，R2=0.99904）。

2.1.5 精密度實驗

按標準曲線確定的范圍內，精密吸取葡萄糖對照品溶液6份，各1mL，按照2.1.3項下操作測定吸光度，計算RSD=2.4%，精密度良好，符合方法學要求。

2.1.6 穩定性實驗

在標準曲線確定的范圍內，精密吸取2.1.2項下制備的供試品1mL，分別于0h，2h，4h，6h按照2.1.3項下操作測定吸光度，計算其RSD=0.88%，穩定性良好，符合方法學要求。

2.1.7 重復性實驗

在標準曲線確定的范圍內，精密量取2.1.2項下制備的供試品1mL，按照2.1.3項下操作測定吸光度，連續測定6次，計算RSD=3.2%，重復性良好，符合方法學要求。

2.1.8 加樣回收率實驗

取已知含量的石斛粉末100mg，精密稱定，共六份，分別加入適量的對照品溶液，按照2.1.3項下操作測定吸光度，計算提取回收率，RSD=3.4%，加樣回收率合格，符合方法學要求。

2.2 石斛總多糖提取工藝考察

以提取溫度、提取時間、料液比、提取次數為因素，選用L9（34）正交表進行正交實驗（表1）。進而得到石斛總多糖加熱回流提取的最優條件。石斛總多糖最佳提取條件正交實驗表見表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結果

表3 正交方差分析

從表3計算結果可知，石斛總多糖提取效果的因素影響為C＞A＞B＞D，最佳工藝的組合為A1B3C2D2。以極差最小的D因素為誤差項進行方差分析，結果顯示C因素對石斛總多糖提工藝具有顯著性影響，結合生產實際與成本考慮，選擇A1B3C2D2，即料液比為100:80（mg/mL），提取溫度為100℃，提取時間為2h，提取次數為2次。

3.討論

通過研究，我們發現對于石斛的總多糖成分的提取影響因素比較多的是提取時間＞料液比＞溫度＞提取次數，最終我們得到的結果是在石斛總多糖的提取過程中應優先考慮提取時間的影響，綜合其他影響因素，得出最佳具有方便，經濟，有效率的提取工藝。

石斛經過加熱回流法提取，最后采用苯酚-硫酸法進行測定其總多糖的含量，該方法簡潔、方便、適用性強，用來評價石斛質量的優劣，具有重要的的意義。對于石斛產業的發展具有巨大的促進意義。