兒茶素對食醋總酚、色率、風味及晚期糖基化產物的影響

羅慶，李艷麗，唐詩淼，陳媛媛，周夢舟，馮年捷，吳茜*

(1.湖北工業大學 生物工程與食品學院，武漢 430068；2．三峽食品藥品檢驗檢測中心，湖北 宜昌 443005；3.湖北工業大學 材料與化學學院，武漢 430068)

近年來，對食品加工中美拉德反應的研究已經變得熱門[1]。在食物的烹飪加熱過程中美拉德反應對食品的色澤和風味具有很大的影響，同時還有著負面作用，最不可忽視的是使蛋白質的營養價值降低[2]。食醋中含有大量美拉德反應所需的底物，同時生產過程中也具備了美拉德反應所需的條件[3]，美拉德反應可能也是醋液香味和色澤的一個重要來源?？寡趸瘎┯泻芎玫那宄杂苫鸵种艫GEs的能力[4]，從而減緩美拉德反應，而兒茶素作為一種優良的天然抗氧化劑，具有細胞調節和預防癌癥等多種功效[5]。

美拉德反應主要指羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質)之間的反應[6]，其終產物之一是晚期糖基化終產物(AGEs)。蛋白質糖基化產生AGEs的病理作用已被許多研究報道[7]，AGEs不僅可以直接影響細胞和組織功能，參與糖尿病并發癥、老化過程及動脈粥樣硬化等疾病的發生發展，也可以通過與受體特異性結合，激發信號通路轉導來改變蛋白質和細胞功能，從而導致病變[8]。

本文探究了兒茶素對不同種類食醋在不同時間段的總酚、色率、AGEs抑制率和食醋內揮發性成分的變化，間接評估了兒茶素減緩美拉德反應發生的程度，為防止食醋在儲藏過程中有害物質的增加和提高食醋品質安全奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同食醋原樣(白醋、米醋、蘋果醋、橘子醋、西瓜醋、魔芋醋、固態發酵醋)：購于淘寶天貓超市；福林酚試劑：上海源葉生物科技有限公司；琥珀酸、碳酸鈉、甘氨酸、木糖、二辛醇：國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸：五峰赤誠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計 北京瑞麗分析儀器有限公司；AR323CN型電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；pH計 雷磁-上海儀電科學儀器股份有限公司；F-7000型熒光分光光度計 日立高新技術有限公司；7200型安捷倫氣相色譜/四級桿飛行時間質譜儀 上海百賀儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同食醋樣品和模擬醋樣的制備

取8組5 mL不同食醋樣分別加入到15 mL的離心管中，分別加入濃度為0.01，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/mL的兒茶素1 mL，并用蒸餾水代替兒茶素為對照組，搖勻，放置于50 ℃恒溫培養箱。

準確稱取甘氨酸6.0056 g和木糖12.0104 g(摩爾比為1∶1)，分別用pH為3.5的琥珀酸緩沖液定容至100 mL，準確稱取兒茶素100 mg，琥珀酸緩沖液定容至100 mL,配制成兒茶素濃度為1.0 mg/mL。根據需要梯度稀釋成濃度為0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.01 mg/mL的兒茶素溶液，取0.8 mol/L的甘氨酸4 mL，0.8 mol/L的木糖4 mL，加入2 mL兒茶素溶液，配制成10 mL的反應液，設置pH為3.5的琥珀酸緩沖液替代兒茶素作為對照組，搖勻，放置于50 ℃。

1.3.2 總酚的測定

標準曲線的繪制：準確稱取一水合沒食子酸0.100 g，用蒸餾水溶解后冷卻定容至100 mL容量瓶中備用，此標準溶液濃度即為1000 mg/L。用移液管分別從此標準溶液中吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0 mL到50 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容后分別得到0，10，20，30，40，50 μg/mL的系列標準溶液。依次量取系列稀釋后的標準溶液各0.5 mL，然后加入稀釋5倍的福林酚試劑5 mL的水，搖勻，靜置3 min，依次加入15%的碳酸鈉2 mL，加入蒸餾水定容至10 mL，避光顯色1 h后，在760 nm的波長下測定系列標準溶液的吸光度，繪制標準曲線[9]。得總酚的標準曲線為y=9.1143x+0.0416，R2=0.9984。

量取稀釋若干倍的樣液0.5 mL，按照制作標準曲線的方法依次加樣，避光顯色1 h后，在760 nm的波長下測定樣品溶液的吸光值。

1.3.3 色率的測定[10]

將待測醋液離心后(4000 r/min，10 min)得澄清醋液，將其稀釋5倍，取適量移入1 cm的石英比色皿中，用分光光度計于610 nm處測定其光密度值，以蒸餾水作為空白，按下式計算EBC色率，其中EBC意義在于：當610 nm處光密度為0.076時，設定為20000 EBC單位。

注：A610 nm表示樣品在波長為610 nm處的吸光度。

1.3.4 AGEs抑制率的測定

AGEs大多具有熒光性，可通過熒光法檢測其含量。激發波長370 nm，發射波長440 nm，分別測定真實醋樣和模擬醋樣稀釋20倍后，相同溫度50 ℃下，放置2，5，10，15天的各個樣液中的熒光強度的變化值以及添加不同濃度的兒茶素后的抑制率。

1.3.5 食醋中揮發性物質的測定

1.3.5.1 樣品預處理

先將萃取頭裝入手柄，插入250 ℃氣相色譜進樣口老化40 min至無雜峰。分別將醋樣用無菌蒸餾水稀釋到酸度為4 g，統一酸度。稱取10 mL原醋樣和10 mL醋樣與兒茶素的混合液(體積比為9∶1)，兒茶素濃度為0.2 mg/mL，加入到20 mL頂空微萃取樣品瓶中，放入轉子，加入40 μL提前配好的二辛醇稀釋液，蓋上蓋子，插入萃取頭，固定在50 ℃磁力攪拌恒溫水浴鍋內，平衡20 min后推下纖維頭繼續萃取20 min，然后收起纖維頭，拔下萃取頭，插入氣相色譜質譜聯用儀的氣相色譜進樣口，推下纖維頭，于250 ℃解吸4 min，抽回纖維頭后拔出萃取頭，同時啟動儀器采集數。

1.3.5.2 儀器條件[11]

色譜條件：色譜柱，DB-WAX毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；通入保護氣氦氣(He)；流速：0.9 mL/min；進樣口溫度：250 ℃，不分流。程序柱溫：起始溫度40 ℃，5 min。階段一：以4 ℃/min升溫至120 ℃，運行25 min。階段二：以8 ℃/min升溫至200 ℃，保持5 min，運行40 min后至260 ℃。

質譜條件：電子離子(electronionization，EI)；接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，質量掃描范圍33～450 amu。

2 結果與分析

2.1 不同濃度兒茶素對食醋中總酚含量的影響

以不加兒茶素的原醋樣作對照組，隨著所添加兒茶素濃度的增大，不同品種的食醋中總酚的含量均會增大；隨放置天數的增加，白醋、蘋果醋等6種醋樣中總酚含量變化不太明顯，固態發酵醋原樣變化最為明顯[12，13]，在50 ℃條件下放置2天后，其總酚含量從0.335 mg/mL增長到1.107 mg/mL，且2天后，隨著放置天數的增加，固態發酵醋中的總酚含量增長減緩。由于發酵方式的不同[14]，固態發酵填充物(例如麩皮)中含有些許多酚、黃酮、VE等具有抗氧化功效的成分，這些物質在醋酸發酵的過程中被溶出，增強其抗氧化活性，這與羅秀麗等人的研究成果一致[15]。不同食醋中添加不同濃度的兒茶素的總酚測定結果見表1。

表1 不同濃度的兒茶素對不同食醋中總酚含量的影響

續 表

2.2 不同濃度兒茶素對食醋中色率的影響

醬油、食醋等發酵制品在發酵過程中會發生美拉德反應，顏色會加深[16]。由表1可知，白醋、米醋、蘋果醋使用方法1.3.3測定的值較小，說明以上3組醋液在放置的過程中發生的美拉德反應程度較弱，加入不同濃度的兒茶素后，對其美拉德反應抑制效果不明顯，且部分醋液運用方法1.3.3難以準確檢測其美拉德反應發生程度。從橘子醋、西瓜醋、魔芋醋和固態發酵醋的數據可以看出，隨著放置天數的增加，原樣醋中的色率會增加，這說明醋液在50 ℃下能夠加速其美拉德反應的發生。

表2 不同濃度兒茶素對不同食醋中色率值的影響

續 表

注：ND表示未檢出。

由表2可知，隨著不同濃度兒茶素的加入，加入了兒茶素的醋樣中的色率值遠小于原樣值，這說明加入了兒茶素的醋樣中美拉德反應的發生程度減弱，同時，通過色率的測定，可以得出兒茶素能夠抑制美拉德反應的產生，且隨著加入的兒茶素濃度的增大，抑制效果越好。

2.3 不同濃度兒茶素對AGEs的抑制效果

2.3.1 不同濃度兒茶素對模擬醋液中AGEs的抑制效果

不同濃度兒茶素添加到模擬醋液中，對其熒光性AGEs的抑制率的影響，見圖1。

圖1 不同濃度兒茶素對模擬醋液中AGEs的抑制率變化

在相同的放置溫度下，隨著兒茶素濃度的增加，相對抑制率亦增加；隨著放置天數的增加，相對抑制率亦增加。對比參照2.3.2中數據可以看出，放置相同的溫度和時間，在添加相同濃度的兒茶素的條件下，模擬醋液的抑制效果均高于真實醋液。這說明按醋液中還原糖和氨基氮配制的醋液模擬液在50 ℃條件下，能較大程度發生美拉德反應，產生晚期糖基化終末產物；間接說明真實醋液中可能存在能夠加速美拉德反應的因子，即在真實醋液中美拉德反應更容易發生。

2.3.2 不同濃度兒茶素對真實食醋樣中AGEs的抑制效果

圖2 不同濃度兒茶素對白醋中AGEs的抑制率變化

圖3 不同濃度兒茶素對米醋中AGEs的抑制率變化

圖4 不同濃度兒茶素對蘋果醋中AGEs的抑制率變化

圖5 不同濃度兒茶素對橘子醋中AGEs的抑制率變化

圖6 不同濃度兒茶素對西瓜醋中AGEs的抑制率變化

圖7 不同濃度兒茶素對魔芋醋中AGEs的抑制率變化

圖8 不同濃度兒茶素對固態發酵醋中AGEs的抑制率變化

由圖2～圖8可知不同濃度的兒茶素對不同種類的食醋中熒光性AGEs的抑制效果。在相同的放置溫度(50 ℃)下，隨著兒茶素濃度的增加，每種食醋中的相對抑制率亦增加。隨著放置天數的增加，各個濃度的兒茶素對食醋中熒光性AGEs的抑制效果增加。白醋、米醋等4種醋樣在添加濃度為0.8，1.0 mg/mL的兒茶素后，放置10，15天后對食醋中熒光性AGEs的抑制效果達到了90%左右；部分食醋在放置10天后，抑制率開始有些許的下降，這是由于放置過程中食醋樣品發生了返渾的現象[17]。返渾可能造成的原因有生物性返渾(主要有嗜酸耐熱芽孢桿菌屬、葡萄桿菌屬等)和非生物性返渾(非生物因素有蛋白質、還原糖和單寧等)，這些因素會加劇美拉德發生的發生。

2.4 不同濃度兒茶素對食醋中揮發性物質的影響

表3 GC-MS分析兒茶素對橘子醋中揮發性成分的影響

續 表

注：ND表示未檢出。

由表3可知，從橘子醋原樣液中共鑒定出了21種成分，即酸類5種、醇類3種、酯類4種、醛類1種、酮類1種、其他物質7種；從橘子醋與兒茶素的混合液中共鑒定出22種成分，即酸類4種、醇類4種、酯類3種、醛類2種、酮類1種、其他物質8種。測定的2組樣液中均含有的酸類有3種(乙酸、異戊酸、琥珀酸)、醇類2種(乙醇、3-丁炔-1-醇)、酯類2種(2-甲基丁基乙酸酯、乙酸苯乙酯)、其他物質4種(三甲基吡嗪、庚烷、甲酰肼、二甲酰肼)，其中添加兒茶素組中的乙酸含量為37.658%，大于原醋樣中30.196%的乙酸含量，說明兒茶素的添加可能促進食醋中乙酸的生成；隨著兒茶素的添加，食醋中酯類物質均增加，其中2-甲基丁基乙酸酯的含量由4.326%增長至14.027%，乙酸苯乙酯的含量由0.238%增長至0.541%，而酯類物質是醋液中揮發性香味成分的主要來源[18]，包括乙酸異戊酯、乙酸乙酯、苯甲酸乙酯等均是其揮發性香味的主要構成成分[19]，間接說明兒茶素的添加可能促進食醋中香味的產生；兒茶素的添加，減少了糠醇向糠醛的轉化，而醛類物質是產生AGEs的前體物質，間接說明食醋中AGEs的含量減少，提高了食醋的質量安全品質。

3 討論

食醋的生產原料中含有大量能夠促進美拉德反應的反應物，也滿足美拉德反應的條件，因此食醋在生產過程中發生美拉德反應是可能的，這也是影響食醋營養物質和色澤的一個重要因素。通過測定真實醋液與模擬醋液中食醋中AGEs的含量及抑制率，說明食醋中存在的大量還原糖和蛋白質使得食醋在儲藏過程中發生了美拉德反應，而模擬醋液的抑制效果更好，則表明真實食醋中還存在著其他能夠促進美拉德反應的因子。

兒茶素作為一種天然的抗氧化劑，添加不同濃度到模擬醋液與真實醋液中，得出：隨著兒茶素濃度的增加，食醋液中的總酚含量也增加，且與濃度呈正相關；食醋液中的色率會降低，說明兒茶素能夠抑制食醋在儲藏過程中美拉德反應的發生；通過對比模擬醋液與真實醋液中兒茶素對AGEs的抑制效果，得出兒茶素能夠抑制食醋中AGEs的產生，且抑制效果與兒茶素濃度呈正相關性；兒茶素的添加，使得食醋中的部分酸類和酯類的含量增加，而酸類與酯類正是食醋中風味與呈味物質的重要組成物質，間接表明兒茶素的添加能夠促進食醋風味物質與呈味物質的產生，同時也減少糠醇向糠醛的轉化，而醛類物質是產生AGEs的前體物質，間接說明兒茶素的添加能夠減少AGEs的產生，保證食醋儲藏過程中的安全和品質。