嗜鹽古菌Halorussus sp. XZYJ18產(chǎn)胞外蛋白酶特點(diǎn)及其酶學(xué)性質(zhì)

侯靖，徐佳琪，崔恒林

(江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

蛋白酶是一類(lèi)非常重要的水解酶，目前在全球酶制劑市場(chǎng)占到46%的份額，廣泛應(yīng)用于食品、洗滌、醫(yī)藥、皮革等領(lǐng)域[1]。在調(diào)味品如醬油、食醋、腐乳生產(chǎn)中，添加蛋白酶有利于蛋白質(zhì)降解，既可提高原料利用率，縮短發(fā)酵周期，降低生產(chǎn)成本，又可改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量和風(fēng)味。目前商業(yè)化的蛋白酶在高鹽等極端環(huán)境中不能有效地發(fā)揮作用，限制了在高鹽調(diào)味品生產(chǎn)中的應(yīng)用。

嗜鹽古菌通常生活在高鹽環(huán)境如鹽湖、鹽場(chǎng)、鹽礦和腌制品中。研究表明，嗜鹽古菌胞外蛋白酶可以應(yīng)用于一些極端環(huán)境，如有機(jī)溶劑中多肽合成[2]、縮短高鹽調(diào)味品魚(yú)露發(fā)酵周期等[3]，從而填補(bǔ)了蛋白酶的應(yīng)用空白[4]。然而，目前報(bào)道的嗜鹽古菌胞外蛋白酶通常依賴高鹽環(huán)境維持活性和穩(wěn)定性[5-11]，低鹽條件不可逆變性失活，從而增加了純化難度以及限制了應(yīng)用范圍。從自然環(huán)境中篩選耐鹽、穩(wěn)定性強(qiáng)的嗜鹽古菌胞外蛋白酶成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)[12，13]。我國(guó)高鹽環(huán)境豐富多樣，為嗜鹽古菌蛋白酶資源的研究提供了很好的材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

從西藏芒康鹽井古鹽田分離的133株嗜鹽古菌。

PCR擴(kuò)增試劑盒、酪蛋白、脫脂奶粉：購(gòu)自上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司。NHM培養(yǎng)基、HM培養(yǎng)基、CM培養(yǎng)基按文獻(xiàn)[14]配制。pH 6.0緩沖液為50 mmol/L磷酸-氫氧化鈉緩沖液；pH 7.0，8.0，9.0緩沖液均為50 mmol/L Tris-HCl緩沖液；pH 10.0，11.0緩沖液均為50 mmol/L硼砂-氫氧化鈉緩沖液。

1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平 上海精科天平儀器廠；pHS-3TC型酸度計(jì) 上海天達(dá)儀器有限公司；HBA-1151 PCR儀 MJ Research公司；Avanti J-14離心機(jī) Beckman公司； DU800核酸蛋白分析儀 Beckan-Coulter公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)胞外蛋白酶能力的初步評(píng)價(jià)

取5 μL菌液接種含5 g/L脫脂奶粉的NHM平板，37 ℃培養(yǎng)，通過(guò)觀察菌苔周?chē)呐Ｈ榈鞍姿馊ΓY選產(chǎn)胞外蛋白酶菌株。根據(jù)牛乳蛋白水解圈直徑與菌苔直徑之比初步評(píng)價(jià)牛乳蛋白水解能力。類(lèi)似地，將菌液接種含5 g/L明膠的NHM平板，將Frazier試劑(HgCl215 g；濃HCl 20 mL；無(wú)菌水100 mL)滴加于菌苔周?chē)鷻z測(cè)明膠水解圈。根據(jù)明膠水解圈直徑與菌苔直徑之比初步評(píng)價(jià)明膠水解能力。

1.3.2 培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)胞外蛋白酶能力的影響

取5 μL經(jīng)NHM，HM和CM培養(yǎng)基活化后的菌液分別接種含5 g/L脫脂奶粉或明膠的NHM，HM和CM平板，于37 ℃培養(yǎng)7天，肉眼觀察牛乳蛋白水解圈，用Frazier試劑檢測(cè)明膠水解圈。

1.3.3 16S rRNA基因序列分析

以水裂解法提取嗜鹽古菌基因組作為PCR模板。PCR擴(kuò)增引物為0018F和1518R[15]。PCR產(chǎn)物由北京諾賽基因組研究中心測(cè)序。NCBI BLAST用于基因序列分析。

1.3.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)

經(jīng)NHM培養(yǎng)基活化后的2 mL XZYJ18菌液接種到100 mL NHM培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。取0.5 mL菌液置于4.5 mL NHM培養(yǎng)基中，充分混勻，此時(shí)稀釋度為10-1，依次稀釋至10-7；10-6和10-7稀釋度樣品分別取0.5 mL均勻平鋪NHM平板(3個(gè)平行)，37 ℃培養(yǎng)7天。取菌落數(shù)在25～250之間的平板計(jì)數(shù)。細(xì)胞數(shù)目(cfu/mL)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×2。采用類(lèi)似的方法測(cè)定NHMY培養(yǎng)基(NHM培養(yǎng)基添加5 g/L酵母提取物)中的細(xì)胞數(shù)目。

1.3.5 蛋白酶活力的測(cè)定

經(jīng)NHM或NHMY培養(yǎng)基活化后的4 mL XZYJ18菌液接種到200 mL NHM或NHMY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至穩(wěn)定期。培養(yǎng)液離心去除細(xì)胞，上清經(jīng)超濾離心管(10 kDa，Millipore)濃縮10倍后，再用一定pH、NaCl濃度的緩沖液將酶液稀釋10倍用于調(diào)節(jié)酶液的pH、NaCl濃度，即得胞外蛋白酶粗酶液。參照文獻(xiàn)[14]，根據(jù)福林酚法測(cè)定蛋白酶活力。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.6.1 溫度對(duì)蛋白酶活性的影響

按1.3.5所述方法于2 mol/L NaCl、pH 7.0的條件下測(cè)定35，40，45，50，55，60，65，70 ℃下的酶活力，探究XZYJ18胞外蛋白酶的最適反應(yīng)溫度。

1.3.6.2 pH對(duì)蛋白酶活性的影響

按1.3.5所述方法在2 mol/L NaCl、最適溫度下測(cè)定pH 6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0下的酶活力，探究XZYJ18胞外蛋白酶的最適反應(yīng)pH。

酶液于2 mol/L NaCl、pH 6.0，8.0，10.0的條件下于30 ℃放置0，20，40，60 min后，按1.3.5所述方法于2 mol/L NaCl、最適pH、最適溫度下測(cè)定酶活力，探究XZYJ18胞外蛋白酶的酸堿穩(wěn)定性。

1.3.6.3 NaCl濃度對(duì)蛋白酶活性的影響

按1.3.5所述方法在最適溫度、最適pH下測(cè)定0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mol/L NaCl下的酶活力，探究XZYJ18胞外蛋白酶的最適反應(yīng)NaCl濃度。

酶液于最適pH、0，1.0，2.0，3.0 mol/L NaCl的條件下于30 ℃放置0，20，40，60 min，按1.3.5所述方法在1.5 mol/L NaCl、最適溫度、最適pH下測(cè)定酶活力，探究XZYJ18胞外蛋白酶的NaCl濃度穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)定3次，采用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析和事后檢驗(yàn)(Turkey法)，顯著水平設(shè)為0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)胞外蛋白酶菌株的篩選

由于嗜鹽古菌遺傳操作和生物化學(xué)技術(shù)建立得相對(duì)較晚，相對(duì)于豐富的高鹽環(huán)境和嗜鹽古菌資源，嗜鹽古菌胞外蛋白酶的研究相對(duì)較少。我國(guó)西藏芒康鹽井古鹽田歷史悠久，仍然保持著原始手工曬鹽方式。課題組前期研究了芒康鹽井古鹽田中可培養(yǎng)嗜鹽古菌的多樣性，本研究擬從分離的嗜鹽古菌中篩選高產(chǎn)胞外蛋白酶菌株。脫脂奶粉中含有大量的蛋白質(zhì)，其中2種主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白和乳清蛋白，可采用脫脂奶粉平板驗(yàn)證產(chǎn)胞外蛋白酶能力。

表1 產(chǎn)胞外蛋白酶菌株篩選結(jié)果Table 1 The screening results of extracellular protease producing strains

續(xù) 表

由表1可知，用NHM-脫脂奶粉平板篩選從西藏芒康鹽井古鹽田分離的133株嗜鹽古菌，共獲得11株產(chǎn)胞外蛋白酶菌株，分別為XZYJ18，XZYJ21，XZYJ25，XZYJT10，XZYJT24，XZYJT35，XZYJT36，XZYJT51，XZYJT58，XZYJT63和XZYJT71。16S rRNA基因序列分析表明XZYJ18，XZYJ21，XZYJ25，XZYJT10，XZYJT24，XZYJT36，XZYJT51，XZYJT58，XZYJT63和XZYJT71的最相近菌株為Halorussusrarus，16S rRNA基因序列的相似性為94%～96%；XZYJT35的最相近菌株為Halomicrobiumzhouii，16S rRNA基因序列的相似性為91%。16S rRNA基因序列相似性小于98.65%通常認(rèn)為屬于不同的種[16]，相似性小于95%認(rèn)為屬于不同的屬[17]。因此，這11株嗜鹽古菌可能為新的分類(lèi)單元，可能存在新型胞外蛋白酶資源。

通過(guò)牛乳蛋白和明膠水解圈直徑與菌苔直徑之比初步探究胞外蛋白酶酶活。結(jié)果表明，除了XZYJT35外，其他10株菌牛乳蛋白水解圈直徑與菌苔直徑比值均大于或等于2，明膠水解圈直徑與菌苔直徑比值均大于3，其中XZYJ18的比值最大，分別為5.2和9.6，表明XZYJ18的胞外蛋白酶具有較強(qiáng)的牛乳蛋白和明膠水解能力。用NHM培養(yǎng)基對(duì)這11株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵制備酶液，測(cè)定35 ℃、2 mol/L NaCl、pH 7.0條件下的酶活，XZYJ18酶活最高(p<0.05)，為9.6 U/mL，其他均低于或等于8.0 U/mL。總的來(lái)說(shuō)，平板上水解圈直徑大小和搖瓶發(fā)酵蛋白酶活力的高低大致一致。XZYJ18用于后續(xù)蛋白酶合成條件和酶學(xué)性質(zhì)研究。XZYJ18為Halorussus屬的新種，這是首次報(bào)道Halorussus屬具有產(chǎn)胞外蛋白酶能力，對(duì)高鹽環(huán)境中胞外蛋白酶資源的研究有利于豐富產(chǎn)蛋白酶嗜鹽古菌物種的種屬分布。

2.2 營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)XZYJ18蛋白酶合成的影響

圖1 XZYJ18在NHM-脫脂奶粉(a)、HM-脫脂奶粉(b)、CM-脫脂奶粉(c)、NHM-明膠(d)、HM-明膠(e)、CM-明膠(f)平板上培養(yǎng)7天的水解圈Fig.1 The hydrolysis zones of XZYJ18 cultured on NHM-milk (a), HM-milk (b), CM-milk (c), NHM-gelatin (d), HM-gelatin (e), and CM-gelatin (f) agar plates for 7 days

將XZYJ18菌株分別接種于常用的嗜鹽古菌培養(yǎng)基，即營(yíng)養(yǎng)貧瘠的NHM、營(yíng)養(yǎng)適中的HM、營(yíng)養(yǎng)豐富的CM-脫脂奶粉或明膠平板，通過(guò)蛋白水解圈表征胞外蛋白酶酶活以探究適宜的產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基。由圖1可知，不管是以脫脂奶粉還是明膠作為蛋白酶的水解底物，NHM平板上水解圈均最大，HM平板上水解圈次之，CM平板上未產(chǎn)生明顯水解圈。這可能是由于XZYJ18菌株在NHM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，在HM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)次之，在CM培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)。隨后，通過(guò)在NHM培養(yǎng)基中添加5 g/L酵母提取物(NHMY)探究營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)XZYJ18生長(zhǎng)及胞外蛋白酶合成的影響。

表2 XZYJ18在不同培養(yǎng)基中的胞外蛋白酶活性Table 2 Extracellular protease activities of XZYJ18 cultured in different media

由表2可知，與NHM培養(yǎng)基相比，在NHMY培養(yǎng)基中，XZYJ18生長(zhǎng)達(dá)穩(wěn)定期時(shí)細(xì)胞數(shù)目增加了3.6倍，但酶活僅增加了60%，表明酵母提取物的添加導(dǎo)致單個(gè)細(xì)胞的酶活降低，約降低了64%，暗示了營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基可能會(huì)抑制蛋白酶合成。D' Alessandro等人發(fā)現(xiàn)嗜鹽古菌Natrialbamagadii營(yíng)養(yǎng)受限時(shí)能夠大量積累胞外蛋白酶[18]，推測(cè)胞內(nèi)能量匱乏誘導(dǎo)了胞外蛋白酶的合成，從而降解蛋白質(zhì)大分子用于提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的能量。另外，XZYJ18在NHM培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h達(dá)到穩(wěn)定期，然而，在NHMY培養(yǎng)基中，需要168 h才能達(dá)到穩(wěn)定期。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，采用NHM培養(yǎng)基培養(yǎng)XZYJ18菌株合成胞外蛋白酶。

2.3 生長(zhǎng)時(shí)期依賴的胞外蛋白酶合成

圖2 XZYJ18產(chǎn)胞外蛋白酶與細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系Fig.2 The relationship between extracellular protease production and cell growth of XZYJ18

由圖2可知，XZYJ18在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期開(kāi)始大量合成胞外蛋白酶，當(dāng)菌體生長(zhǎng)達(dá)穩(wěn)定期后，酶活最高并趨于穩(wěn)定，推測(cè)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗盡或者群感效應(yīng)信號(hào)分子誘導(dǎo)了胞外蛋白酶的產(chǎn)生。同樣地，嗜鹽古菌Natrialbamagadii也是在對(duì)數(shù)期向穩(wěn)定期過(guò)渡時(shí)大量產(chǎn)生胞外蛋白酶，認(rèn)為穩(wěn)定期培養(yǎng)液中存在某種疏水的分子能夠誘導(dǎo)胞外蛋白酶合成[19]。然而，石萬(wàn)良等人研究的嗜鹽古菌Natrinemasp. R6-5胞外蛋白酶合成與生長(zhǎng)幾乎同步[20]，這說(shuō)明嗜鹽古菌中存在不同的蛋白酶合成調(diào)控機(jī)制。對(duì)嗜鹽古菌蛋白酶合成條件的研究能夠?yàn)榘l(fā)酵條件的優(yōu)化提供指導(dǎo)，從而有利于其大規(guī)模生產(chǎn)用于基礎(chǔ)研究或工業(yè)應(yīng)用。

2.4 XZYJ18胞外蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 溫度對(duì)蛋白酶活性的影響

取培養(yǎng)至穩(wěn)定期的培養(yǎng)液用于酶液制備及酶學(xué)性質(zhì)研究。

圖3 溫度對(duì)XZYJ18胞外蛋白酶酶活的影響Fig.3 Effect of temperature on extracellular protease activities of XZYJ18

由圖3可知，在35～70 ℃內(nèi)，XZYJ18胞外蛋白酶活性隨著溫度升高先升高后降低，55 ℃時(shí)酶活最高(p<0.05)，在45～60 ℃內(nèi)，酶活為最高酶活的80%以上。因此，與已報(bào)道的大部分嗜鹽古菌胞外蛋白酶一樣，XZYJ18的胞外蛋白酶具有一定的耐熱性。食品發(fā)酵通常要求在一定的溫度維持一段時(shí)間，因此，蛋白酶的耐熱性對(duì)于在食品工業(yè)中的應(yīng)用非常重要。

2.4.2 pH對(duì)蛋白酶活性的影響

圖4 pH對(duì)XZYJ18胞外蛋白酶酶活的影響Fig.4 Effect of pH on extracellular protease activities of XZYJ18

由圖4可知，在pH 6.0～11.0內(nèi)，XZYJ18胞外蛋白酶活性隨著pH升高先升高后降低，pH 8.0時(shí)酶活最高(p<0.05)，pH 7.0時(shí)酶活為最高酶活的81%，pH 9.0時(shí)酶活為最高酶活的76%。因此，XZYJ18胞外蛋白酶在中性和弱堿性條件下酶活較高。

圖5 XZYJ18胞外蛋白酶的酸堿穩(wěn)定性Fig.5 Stability of extracellular protease activities of XZYJ18 at different pH values

由圖5可知，XZYJ18胞外蛋白酶在pH 6，8，10的條件下放置20，40，60 min酶活均沒(méi)有顯著變化(p>0.05)，表明其具有良好的酸堿穩(wěn)定性，因而在酸性或堿性條件下均能催化蛋白質(zhì)水解，可應(yīng)用于不同的食品工業(yè)。

2.4.3 NaCl濃度對(duì)蛋白酶活性的影響

嗜鹽古菌為高鹽環(huán)境中的主要微生物類(lèi)群，嚴(yán)格依賴于高濃度的NaCl生長(zhǎng)。嗜鹽古菌通過(guò)胞內(nèi)積累高濃度的K+來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡。高鹽環(huán)境中的嗜鹽古菌蛋白質(zhì)進(jìn)化出了一系列獨(dú)特的特征與機(jī)制[21]，賦予了嗜鹽古菌酶類(lèi)良好的耐鹽性。

圖6 NaCl濃度對(duì)XZYJ18胞外蛋白酶酶活的影響Fig.6 Effect of NaCl concentration on extracellular protease activities of XZYJ18

由圖6可知，當(dāng)NaCl濃度為0～1.5 mol/L時(shí)，XZYJ18胞外蛋白酶活性隨著鹽濃度增加逐漸降低。當(dāng)NaCl濃度為1.5～3.0 mol/L時(shí)，XZYJ18胞外蛋白酶活性沒(méi)有明顯變化(p>0.05)，約為最高酶活的62%。因此，雖然XZYJ18菌株分離于高鹽環(huán)境，其胞外蛋白酶卻在無(wú)鹽條件下展示最高酶活，但在高NaCl濃度下也能保持較高酶活。

圖7 XZYJ18胞外蛋白酶的鹽度穩(wěn)定性Fig.7 Stability of extracellular protease activities of XZYJ18 at different NaCl concentration

由圖7可知，XZYJ18胞外蛋白酶在0，1，2，3 mol/L NaCl下放置20，40，60 min，酶活均沒(méi)有明顯變化(p>0.05)。目前報(bào)道的大部分嗜鹽古菌胞外蛋白酶依賴于高鹽環(huán)境高效發(fā)揮作用，如HalogeometricumborinquenseTSS101的胞外蛋白酶最適反應(yīng)NaCl濃度為20%，在沒(méi)有NaCl的條件下完全失活[22]；Natrinemasp. R6-5的胞外蛋白酶在3 mol/L NaCl的條件下酶活最高，在0.5 mol/L NaCl的條件下酶活為最高酶活的40%。因此，不同于很多高鹽依賴的嗜鹽古菌蛋白酶，XZYJ18胞外蛋白酶在高、低NaCl濃度下均具有較高活性及穩(wěn)定性，該特性使得它能夠應(yīng)用于不同鹽濃度的環(huán)境中，因而在食品工業(yè)將具有廣泛應(yīng)用。

3 結(jié)論

本研究從分離自我國(guó)西藏芒康鹽井古鹽田的133株嗜鹽古菌中篩選出11株產(chǎn)胞外蛋白酶菌株，其中，Halorussussp. XZYJ18胞外蛋白酶酶活最高。XZYJ18在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期開(kāi)始大量合成胞外蛋白酶，營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基會(huì)抑制蛋白酶的合成。XZYJ18蛋白酶對(duì)溫度、pH、鹽度均有較好的耐受性，因而將在高鹽調(diào)味品發(fā)酵等工業(yè)過(guò)程中具有廣泛的應(yīng)用潛力。本研究能夠?yàn)槭塞}古菌蛋白酶的大規(guī)模生產(chǎn)以及工業(yè)應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。