響應(yīng)面法優(yōu)化野生紫蘇籽油提取工藝及其抗氧化活性

曹小燕,楊海濤

(1.陜西理工大學(xué)陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000)

紫蘇(PerillafrutescensL.)又稱為紅蘇、白蘇、蘇麻等，是一種常用的藥食兩用植物[1]。紫蘇全身是寶，其葉、莖、根和籽均可入藥，具有抗菌、抗炎、抗過敏、預(yù)防癌癥、降血脂和血壓、保護(hù)肝脾等功效[2]。近年來，由于其獨(dú)特的活性組分和廣闊的應(yīng)用范圍越來越受到人們的關(guān)注。紫蘇籽為紫蘇成熟的果實(shí)，具有行氣和胃、解表散寒、治療妊娠反應(yīng)和胎動不安等功效。紫蘇籽含有40%～50%的油脂，不飽和脂肪酸含量達(dá)90%以上，其中α-亞麻酸含量占55%～65%[3]。紫蘇籽油還富含黃酮、多酚、微量元素、甾醇和VE等活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗癌和預(yù)防老年癡呆等功效[4]。近年來，隨著人們對紫蘇籽油營養(yǎng)保健功效認(rèn)識的不斷深入，紫蘇籽油作為一種重要的油料作物已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，如謝慧等[5]采用改良索式抽提法優(yōu)化了紫蘇籽油的提取工藝；宋曙輝等[6]采用微波輔助法優(yōu)化了紫蘇籽油的最優(yōu)工藝；胡穎等[7]采用超臨界 CO2結(jié)合夾帶劑乙酸乙酯優(yōu)化提取了紫蘇籽油的提取工藝，其得油率為36.7%。程雪等[8]采用熱處理輔助水酶法得到紫蘇籽油的提取率為59.02%。由此可見，紫蘇籽油作為一種新型營養(yǎng)保健食用油，不同的提取方法對其得油率和油品也有很大的影響。

目前，從原料中提取油的方法有機(jī)械壓榨法、化學(xué)萃取法、索氏提取法、超臨界CO2萃取法、水酶法和超聲波輔助提取法等[9-12]。其中超聲波輔助提取法相較于機(jī)械壓榨法和超臨界CO2萃取來說儀器操作簡單；相較于化學(xué)萃取法來說不僅減少了浸出時間和雜質(zhì)的浸出，而且提高了出油品質(zhì)；與水酶法比較，操作易于控制。由此可知，超聲波輔助法低成本、低耗能，且利于大規(guī)模生產(chǎn)。近幾年，油脂是否具有抗氧化作用也受到了廣泛的關(guān)注，研究表明較多的油脂對自由基均具有較好的清除作用[13]。因此，本研究采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了紫蘇籽油的提取工藝，并評價了紫蘇籽油的理化性質(zhì)和自由基清除活性，為紫蘇籽油的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 儀器、材料與方法

1.1 儀器與材料

EL104型電子分析天平；722G型可見分光光度計；SB-4200DTD型超聲波清洗機(jī)；JXL-2S-6A型數(shù)顯恒溫水浴鍋；101A-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱；800型離心機(jī)；CL-2型恒溫加熱磁力攪拌器。

紫蘇籽：采集于陜西省勉縣，分別進(jìn)行晾干、除雜、50 ℃烘干、粉碎、過80目篩后貯藏在干燥容器中備用。石油醚(AR)：60～90 ℃；其他試劑：均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 超聲輔助提取紫蘇籽油

準(zhǔn)確稱取一定量的處理好備用的紫蘇籽粉于燒瓶中，依據(jù)一定的料液比加入石油醚，在一定的超聲功率、提取溫度和提取時間下，進(jìn)行提取、收集提取液、旋轉(zhuǎn)濃縮回收溶劑，得到紫蘇籽毛油，于60 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，稱重。其提取率計算公式如下：

紫蘇籽油提取率(%)=(提取后紫蘇籽油的質(zhì)量/提取前紫蘇籽的質(zhì)量)×100。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

基礎(chǔ)提取條件：超聲功率400 W，提取時間30 min，超聲溫度60 ℃，料液比1∶10。在該基礎(chǔ)條件下適當(dāng)調(diào)整后進(jìn)行不同的提取溶劑(異丙醇、石油醚、正己烷、乙醇、乙酸乙酯)、超聲功率(200,250,300,350,400 W)、提取時間(10,20,30,40,50 min)、超聲溫度(30,40,50,60,70 ℃)、料液比(1∶2,1∶5,1∶10,1∶15,1∶20)的單因素試驗(yàn)，以紫蘇籽油提取率為考察指標(biāo)，優(yōu)選各單因素的最優(yōu)取值范圍。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

以紫蘇籽油提取率為考察指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計的原理，設(shè)計響應(yīng)面分析試驗(yàn)[14]，優(yōu)化超聲輔助提取紫蘇籽油的提取工藝。

1.2.4 紫蘇籽油理化指標(biāo)的測定[15]

水分及揮發(fā)物按照GB 5009.236-2016測定；相對密度按照GB/T 5518-2008測定；皂化值按照GB/T 5534-2008測定；碘值按照GB/T 5532-2008測定；酸值按照GB 5009.229-2016測定；過氧化值按照GB 5009.227-2016測定；折光率按照GB/T 5527-2010測定。

1.2.5 抗氧化活性的測定

對O2-·的清除能力：依據(jù)鄰苯三酚自氧化法[16]；對NaNO2的清除：依據(jù)鹽酸萘乙二胺法[17]；還原能力的測定：采用鐵氰化鉀還原法[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)對紫蘇籽油提取率的影響

以紫蘇籽油收率為評價對象，對可能影響得率的提取溶劑、超聲功率、超聲溫度、提取時間和料液比進(jìn)行了試驗(yàn)篩選，結(jié)果見圖1～圖5。

圖1 提取溶劑對紫蘇籽油提取率的影響

圖2 超聲功率對紫蘇籽油提取率的影響

圖3 提取溫度對紫蘇籽油提取率的影響

圖4 提取時間對紫蘇籽油提取率的影響

圖5 料液比對紫蘇籽油提取率的影響

由圖1可知，5種提取溶劑對紫蘇籽油提取率的差異影響較大，其中石油醚和正己烷的紫蘇籽油產(chǎn)率接近且最大，所得油脂顏色淡黃，透明度高。乙酸乙酯、異丙醇、無水乙醇的提取率依次降低，且乙酸乙酯和異丙醇提取的油脂呈黃綠色，略有渾濁。故后續(xù)試驗(yàn)選擇石油醚(60～90 ℃)為提取溶劑。

由圖2可知，當(dāng)超聲功率在200～250 W時，紫蘇籽油的提取率隨超聲功率的增加而增加；250～300 W之間時，紫蘇籽油的提取率隨超聲功率的增加而增加最快；300～350 W時，紫蘇籽油的提取率隨超聲功率的增加而逐漸降低；350～400 W之間時，雖然紫蘇籽油的提取率隨超聲功率的增加而有所增加，但是增加的幅度明顯小于200～300 W時的增加幅度。結(jié)合超聲波的機(jī)械效應(yīng)與熱效應(yīng)，高功率條件下有可能引起油脂中活性成分的降解等原因，故選擇超聲功率300 W為宜。

由圖3可知，隨著溫度的升高，紫蘇籽油的提取率逐漸增加，60 ℃時達(dá)到最大值；60 ℃以后紫蘇籽油的提取率下降程度非常明顯?？赡苁怯捎诔暅囟冗^高，溶劑揮發(fā)過快，使得浸出過程中無法保持穩(wěn)定的狀態(tài)，導(dǎo)致提取率降低，故選擇超聲溫度40 ℃為宜。

由圖4可知，隨著提取時間的延長，紫蘇籽油的提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，40 min后下降趨勢趨于平緩?？赡苁怯捎诔曁幚淼臅r間過長，產(chǎn)生的空化作用或機(jī)械效應(yīng)使紫蘇籽油中的不飽和脂肪酸發(fā)生了裂解，從而使得紫蘇籽油的提取率下降，故在實(shí)際生產(chǎn)過程中，超聲時間應(yīng)在30 min為宜。

由圖5可知，在1∶2～1∶5時，紫蘇籽油的提取率隨料液比的增大而增加最快；1∶10時提取率達(dá)到最大值；隨后紫蘇籽油的提取率有所下降。由此可見，提取溶劑用量增加，可使較多的紫蘇籽油溶于溶劑中，也可能導(dǎo)致產(chǎn)物中的雜質(zhì)增多，促使提取率降低，故料液比選擇1∶5～1∶15之間較合適。

2.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)，考察超聲功率、超聲溫度、提取時間和料液比對紫蘇籽油提取率的影響，優(yōu)化其提取工藝。響應(yīng)面分析試驗(yàn)的因素與水平見表1；響應(yīng)面分析試驗(yàn)的結(jié)果見表2，其中1～24為分析試驗(yàn)，25～27為零點(diǎn)試驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)的設(shè)計及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

運(yùn)用Design-Expert 8.0統(tǒng)計學(xué)軟件，對表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到Y(jié)與A，B，C，D的二次回歸方程為：Y=-46.015833+0.829583A+1.678667B+2.531000C+0.192633D-0.017167A2+0.002775AB-0.022592B2-0.026250AC+0.000400BC-0.210167C2+0.001405AD+0.000190BD+0.010040CD-0.000592D2。

紫蘇籽油提取率回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果

注：“*”表示差異性顯著，P<0.05；“**”表示差異性極顯著，P<0.01。

2.2.3 確立最佳的提取條件與驗(yàn)證

通過分析響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ停玫阶咸K籽油提取率的預(yù)測值為44.52%，即超聲時間為40.44 min，溫度為31.14 ℃，料液比為1∶11.34 (g/mL)，超聲功率為302.4 W。為了便于實(shí)際操作，設(shè)定超聲時間為40 min，溫度為31 ℃，料液比為1∶11 (g/mL)，超聲功率為300 W， 進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到紫蘇籽油的平均提取率為44.31%，與理論預(yù)測值的誤差為0.47%。因此，本響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ团c實(shí)際情況擬合度良好，優(yōu)化結(jié)果可靠，該工藝參數(shù)具有較高的穩(wěn)定性與實(shí)際應(yīng)用價值。

2.2.4 紫蘇籽油理化指標(biāo)的測定

在最佳工藝條件下得到淡黃色、澄清透明的紫蘇籽油，具有紫蘇特有的氣味，加熱無沉淀生成。蘇籽油的理化性質(zhì)測定結(jié)果見表4。

表4 紫蘇籽油的理化性質(zhì)

由表4可知，其相對密度較大，說明其不飽和程度較高；油中水分及揮發(fā)物的含量較低，易于長期穩(wěn)定保存；酸值和過氧化值接近于1，符合國家食用油的標(biāo)準(zhǔn)，表明其具有較好的抗氧化性能；碘值較高，表明其含有較高的不飽和脂肪酸，油品質(zhì)較好；皂化值高于常見植物油的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步說明其不飽和脂肪酸含量高；折光率也高于一般的油脂。野生紫蘇籽油的酸值、碘值、皂化值和過氧化值均達(dá)到了國家食用植物油的標(biāo)準(zhǔn)，是一種理想的保健用油。

2.3 紫蘇籽油的抗氧化活性

2.3.1 對超氧陰離子自由基(O2-·)的清除能力

O2-·可以在生物體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化或生成其他的氧自由基，引起機(jī)體損傷性疾病。

圖6 對亞硝酸鹽清除活性

由圖6可知，紫蘇籽油的質(zhì)量濃度小于6 mg/mL時，紫蘇籽油對超氧陰離子自由基的清除率小于Vc，由于紫蘇籽油中的活性成分較多，低濃度條件下其自由基清除活性較弱；當(dāng)質(zhì)量濃度大于等于6 mg/mL時，紫蘇籽油對超氧陰離子自由基的清除率明顯高于Vc，且存在明顯的量效關(guān)系，可能是紫蘇籽油中的活性成分存在協(xié)同清除自由基的性能。故紫蘇籽油對超氧陰離子自由基具有較強(qiáng)的清除作用，其清除IC50值為2.49 mg/mL。

2.3.2 對亞硝酸鹽(NaNO2)的清除能力

依據(jù)重氮偶合比色法，在酸性環(huán)境中亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，再與鹽酸萘乙二胺試劑發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，生成的紫紅色偶氮化合物于540 nm處的吸光度值增強(qiáng)。

圖7 對亞硝酸鹽清除活性

由圖7可知，在低質(zhì)量濃度條件下，紫蘇籽油對亞硝基的清除能力明顯低于Vc，其清除效率增長較快且存在明顯的量效關(guān)系，而Vc的清除效率增長平緩。紫蘇籽油對亞硝基的清除IC50值為2.51 mg/mL，表明相同濃度下紫蘇籽油對亞硝酸鹽的清除速率優(yōu)于Vc溶液。

2.3.3 還原能力的測定

利用紫蘇籽油被鐵氰化鉀氧化來表征其還原力。還原力越強(qiáng)表示其給電子能力越強(qiáng)，其自由基清除活性也相對較強(qiáng)，因此常應(yīng)用還原能力表征其抗氧化活性的強(qiáng)弱。

圖8 還原能力的測定

由圖8可知，20～80 g/mL時紫蘇籽油的還原能力呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，80～140 g/mL時，還原能力上升平緩，但總體趨勢優(yōu)于同濃度條件下Vc溶液的還原能力。由此可見，紫蘇籽油的還原能力較為顯著，同時佐證了紫蘇籽油具有較強(qiáng)的自由基清除活性及抗氧化能力。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了超聲輔助提取紫蘇籽油的提取工藝，在最佳的提取工藝參數(shù)為超聲功率300 W、超聲時間40 min、溫度31 ℃、料液比1∶11 (g/mL)的條件下，紫蘇籽油的提取率為44.31%，與理論預(yù)測值的誤差為0.47%，表明該工藝條件穩(wěn)定，切實(shí)可行。

紫蘇籽油的理化性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇籽油為澄清、透明的淡黃色液體，加熱無沉淀生成；相對密度(d420)0.927±0.008；酸值(1.012±0.01) mg/g；碘值(I)(198.21±0.21) g/100 g；皂化值(196.61±0.01) KOH mg/g；過氧化值(1.018±0.01) g/100 g。其酸值、碘值、皂化值和過氧化值均達(dá)到了國家食用植物油的標(biāo)準(zhǔn)，是一種理想的保健用油。

自由基清除活性研究表明，當(dāng)濃度10 mg/mL時，紫蘇籽油對超氧陰離子自由基和亞硝酸鹽的清除率分別高達(dá)69.61%和66.46%，其清除IC50值分別為2.49，2.51 mg/mL；在濃度為0.14 mg/mL時，紫蘇籽油的還原能力為0.671，高于同濃度條件下Vc的自由基清除活性和還原能力。故紫蘇籽油具有良好的抗氧化能力，本研究為其進(jìn)一步的工業(yè)開發(fā)與利用提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。