郫縣豆瓣黃曲霉毒素B1污染狀況及季節變化分析

徐煒楨

(1.西華大學 生物工程學院 食品生物技術四川省高校重點實驗室，成都 610039；2.四川省丹丹郫縣豆瓣股份有限公司，成都 611732； 3.四川友聯味業食品有限公司，成都 611732)

黃曲霉毒素是最常見的一類真菌毒素，是黃色曲霉菌或寄生曲霉菌在生長繁殖過程中產生的一組有毒代謝產物，在自然界中廣泛存在，尤其對玉米[1]、大米[2]、花生[3]、辣椒[4]和豆類發酵食品[5]等造成污染。黃曲霉毒素是次生代謝產物，主要對人類和動物的RNA和DNA的合成進行干擾，當RNA和DNA不能進行合成時會導致細胞蛋白質合成受阻，最后使得動物基因突變，產生致癌物[6]，常見的黃曲霉毒素有B1，B2，G1，G2，M1 5種，其中B1為毒性及致癌、致畸和致突變最強的物質，是一種毒性最強的天然物質。黃曲霉毒素Bl(AFB1)的半數致死量為0.36 mg/kg體重，砒霜的半數致死量是14.6 mg/kg體重，比砒霜大68倍，是一種劇毒物質，損害人和動物的肝臟，造成人和動物代謝系統的紊亂，引起肝細胞壞死、肝硬化，誘發肝癌、胃癌等，嚴重的引起人和動物惡心、嘔吐、死亡等[7]。

郫縣豆瓣屬中國傳統發酵食品，迄今為止已有300多年的歷史，具有味辣香醇、紅棕油亮、粒稠絨實、醬香濃郁的特點，是烹飪川菜必不可少的調味品，在世界發酵辣椒醬中別具一格，它在選材上與工藝上與眾不同，可謂是“川菜之魂”[8,9]。郫縣豆瓣產業是郫縣重要的支柱產業之一，其產業總量已經占中餐總量的35%以上，郫縣豆瓣每年銷售額逐年增加，1999年開始，郫縣豆瓣銷售總量達到5萬噸，銷售收入總額為5萬噸，銷售總收入為2.5億元；在2010年，郫縣豆瓣銷售總量達到45萬噸，銷售總收入為18億元；到2015年末，郫縣豆瓣銷售總量達到110萬噸，銷售總收入為102億元[10]。

郫縣豆瓣在發酵過程中分為發酵制曲階段、發酵初期、發酵后期3個階段[11]。制曲階段主要是通過米曲霉等菌種在原料上生長繁殖，利用它們分泌蛋白酶、肽酶、淀粉酶、糖化酶等多種酶類，是豆瓣生產中最重要的質量控制點[12]；發酵初期階段(10～60天)是將曲瓣子與鹽水按比列混合發酵，制成成熟瓣子(甜瓣子)；發酵后期(60～240天)是先制好甜瓣子，然后將甜瓣子和辣椒按一定比例混合均勻攪拌，隨后加入食鹽和水進行攪拌，倒入發酵池進行發酵，經過一段時間的不斷翻曬和陳化[13]。因為傳統發酵生產豆瓣處于比較粗放的境況：第一，生產用菌不同程度地產生黃曲霉毒素；第二，由于生產所用的米曲霉、黑曲霉等與黃曲霉的生化條件相近，控制不嚴極易被雜菌污染，產生黃曲霉毒素[14]；第三，在郫縣豆瓣發酵的管理過程中很難避免AFB1的污染，而在烹飪過程中也不能將AFB1去除[15]，常出現AFB1超過國家標準限量的問題，帶來食品質量安全隱患。目前，AFB1對食品污染的問題已引起了全國的高度重視，并開展了廣泛的研究，取得了顯著的成果，且各國根據各自的國情制定不同食品及動物飼料中AFB1限量標準，控制或降低AFB1污染對人群健康造成的危害。

為初步了解成都市郫縣豆瓣中AFB1的污染狀況，制定控制措施，提高監管水平，降低風險。我們從不同渠道采集郫縣豆瓣樣品共296批次，在春夏季節和秋冬季節分別為124批次和172批次，對一整年郫縣豆瓣中AFB1進行測定污染情況，然后再分別對秋冬季節郫縣豆瓣中AFB1和春夏季節郫縣豆瓣中AFB1含量進行測定，通過春夏季節與秋冬季節中AFB1含量的變化及比較，來思考季節溫差對郫縣豆瓣中AFB1的影響，以期為郫縣豆瓣的食品安全監管提供可靠依據，為制定郫縣豆瓣中AFB1控制措施提供科學合理的根據。

1 材料與方法

1.1 原料采集

在春夏季節：在春夏季節共取樣124批次，分別來自四川大型企業合計47批次；大型商場(紅光世紀百盛購物廣場、步步高郫縣紅光店、紅旗連鎖、蜀都萬達永輝超市)合計19批次；農貿市場(犀浦農貿市場、青白江成剛菜市場、紅光農貿市場、志陽農貿市場)合計41批次；紅光鎮批發市場合計17批次。

在秋冬季節：在秋冬季節共取樣172批次，分別來自四川大型企業合計88批次；大型商場(紅光世紀百盛購物廣場、步步高郫縣紅光店、紅旗連鎖、蜀都萬達永輝超市)合計23批次；農貿市場(犀浦農貿市場、青白江成剛菜市場、紅光農貿市場、志陽農貿市場)合計44批次；紅光鎮批發市場合計17批次。

1.2 試劑

甲醇(分析純，西隴科學股份有限公司)、石油醚、三氯甲烷(分析純，成都市科龍化工試劑廠)、抗黃曲霉毒素B1(AFB1)抗體酶結合物：1瓶(6 mL)ELISA kit(德國R-Biopharm公司)、顯色液A:1瓶(6 mL)、顯色液B:1瓶(6 mL)、終止液：1瓶(6 mL)，2 mol/L硫酸、樣本稀釋液：1瓶、濃縮洗滌液：1瓶、黃曲霉毒素B1(AFB1)標準品：6瓶(1 mL/瓶)，含量分別是：0，0.2，0.6，1.8，5.4，16.2 μg/L。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取郫縣豆瓣樣品30 g左右，研磨至均勻糊狀后放入保鮮袋中密封保存放入冰箱中備用。

1.3.2 黃曲霉毒素B1提取

提取方法根據國標方法改進[16]，將研磨好的豆瓣從冰箱中取出先在室溫中放置30 min，準確稱取豆瓣15 g，加入到250 mL錐形瓶中，然后加入50.0 mL甲醇-水溶液和15 mL石油醚蓋塞，密封后放入搖床，在150 r/min條件下振蕩30 min，等待搖床停止后，用快速定性濾紙過濾于分液漏斗中，靜止5 min，放出下層溶液至燒杯中，從中取20 mL置于另一分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷，振蕩2 min后等待靜置分層，然后放出下層的三氯甲烷于蒸發皿中，再在分液漏斗中加入10 mL三氯甲烷搖晃振蕩2 min，等待分層后放出下層三氯甲烷于蒸發皿中，將蒸發皿放在70 ℃水浴中揮干，揮干后加入3 mL甲醇溶液，溶解凝結物，將溶液移置試管中保存。

1.3.3 檢測方法

測量方法依據試劑盒說明書上面的方法進行測定，具體如下：取適量微孔板固定在板架上面放于桌面上，先依次加入50 μL標準品溶液，再順序加入50 μL樣品溶液，最后在所有具有溶液的孔中加入50 μL抗黃曲霉毒素B1(AFB1)抗體酶結合物，輕輕晃動幾秒鐘使之混合均勻，置于37 ℃水浴鍋中30 min，在此過程中不時地將板架取出來輕輕地拍打晃動，目的是使之充分混合均勻減少雙孔誤差；水浴結束后，取出孔板甩掉孔中溶液，用洗滌液洗滌微孔板4～5次，最后在吸水紙上拍打除去孔中液體。

1.3.4 反應

洗滌完成甩掉孔中溶液后，在微孔中加入50 μL顯色液A，再加入50 μL顯色液B，輕輕晃動反應板使之徹底混合均勻，再放于37 ℃水浴鍋中水浴10 min，最后在每個孔中加入50 μL終止液。

1.3.5 檢測

待反應完成后在450 nm下檢測吸光度。

1.4 數據處理

測得的標準溶液和樣品溶液的吸光值取平均值，除以第一個標準(0標準)的吸光值的平均值再乘以100%，即百分吸光度，設為Y軸；以黃曲霉毒素B1(AFB1)濃度對數值為X軸，根據標準品測得百分吸光度Y軸與標準品黃曲霉毒素B1(AFB1)濃度對數值X軸的線性關系，繪制標準曲線圖，再根據樣品的百分吸光度值，可以從標準曲線得到對應的橫坐標，即樣品中黃曲霉毒素B1(AFB1)濃度的對數值，然后求其反對數即為樣品溶液中的黃曲霉毒素B1(AFB1)濃度c(μg/L)。樣品中黃曲霉毒素B1含量為：

式中：X為樣品中所含黃曲霉毒素B1含量；c為在標準曲線中每個樣品的百分吸光度值所對應的濃度對數值；k為豆瓣樣品加水稀釋的倍數。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制及總體情況

將系列AFB1標準品溶液(0，0.2，0.6，1.8，5.4，16.2 μg/kg)測得吸光度值，繪制AFB1的標準曲線(見圖1)，以黃曲霉毒素B1(AFB1)濃度對數值為X軸，百分吸光度為Y軸，得到線性方程y=-0.5121x+0.6728，R2=0.99，可知，標準方程的R2在0.99以上，說明在給定的測量條件下標準曲線的線性良好。

圖1 AFB1的標準曲線Fig.1 Standard curve of AFB1

2.2 不同來源郫縣豆瓣樣品中黃曲霉毒素B1的污染情況

表1 不同來源郫縣豆瓣樣品中AFB1的污染情況Table 1 The pollution of AFB1 in the sample of Pixian soybean paste from different sources

注：“ND”表示低于檢測限(0.2 μg/kg)。

由表1可知，AFB1污染情況差異較大，AFB1污染嚴重程度依次為(由大到小排序)農貿市場(3.915 μg/kg)>批發市場(3.495 μg/kg)>大型商超(3.153 μg/kg)>重點企業(2.749 μg/kg)；農貿市場的最高值(7.119 μg/kg)與最低值(2.487 μg/kg)均高于其他3個地方的最高值和最低值，大型商超、批發市場、重點企業合格率均高于平均合格率，只有農貿市場合格率較低，說明農貿市場是AFB1污染最嚴重的，并且農貿市場中郫縣豆瓣產品給消費者帶來的食品安全風險較大，監管部門應該作為重點監管對象，另外，對于消費者來說長期使用含有AFB1含量偏高的豆瓣，對健康有嚴重的危害的，嚴重的可以引起肝損傷，以至癌變，所以消費者應盡量選擇重點企業或者大型商超的豆瓣；同時，從郫縣豆瓣整體來看，合格率在94.60%，一共抽樣296個樣品，就有16個不合格，超過我國在GB 2761-2011《食品安全國家標準 食物中真菌毒素限量標準》中規定黃曲霉毒素B1的限量，其中黃曲霉毒素在發酵豆瓣中的限量不得超過 5 μg/kg。說明AFB1污染郫縣豆瓣總體形勢不容樂觀，在豆瓣中存在安全隱患，監管部門應進一步加強發酵豆瓣中AFB1的防治、檢測與管理。

2.3 不同季節郫縣豆瓣樣品中黃曲霉毒素B1的污染情況

表2 不同季節郫縣豆瓣樣品中AFB1的污染情況Table 2 The pollution of AFB1 in the sample of Pixian soybean paste in different seasons

注：“ND”表示低于檢測限(0.2 μg/kg)。

春、夏季，我們從四川大型企業、農貿市場、大型商超、批發市場等地分別采集樣品共124個，在這124個樣品中，一共檢測了120個樣品，檢出率為96.77%。AFB1超過國家標準限量5.0 μg/kg的樣品共有9個，產品合格率達92.74%。

秋、冬季，我們從四川大型企業、農貿市場、大型商超、批發市場等地分別采集樣品共172個，在這172個樣品中，一共檢測了170個樣品，檢出率為98.88%。AFB1超過國家標準限量5.0 μg/kg的樣品共有6個，產品合格率達96.47%。

在秋冬季節豆瓣中AFB1的平均含量為3.057 μg/kg，在春夏季節豆瓣中AFB1的平均含量為3.566 μg/kg，秋冬季節最高值(6.475 μg/kg)小于春夏季節最高值(7.119 μg/kg)，秋冬季節AFB1合格率為96.47%，春夏季節AFB1合格率為92.74%；可以得出在秋冬季節豆瓣中AFB1污染情況均比在春夏季節豆瓣中AFB1的污染情況小，季節對郫縣豆瓣中AFB1的污染有一定的影響，在秋冬季節比在春夏季節污染情況要低。

3 討論與結論

從一年的總體情況來看，郫縣豆瓣中黃曲霉毒素B1的合格率為94.60%，大型商超、批發市場、重點企業的合格率均高于平均合格率，只有農貿市場的合格率較低，所以可以看出郫縣豆瓣受AFB1的污染總體情況良好，只有農貿市場的情況不容樂觀。

對于春夏季節與秋冬季節郫縣豆瓣中AFB1含量的差異，秋冬季節時郫縣豆瓣中AFB1的合格率明顯低于春夏季節時郫縣豆瓣中AFB1的合格率；在秋冬季節測定AFB1的平均值含量明顯低于在春夏季節測定AFB1的含量；在秋冬季節AFB1最高值、最低值都低于春夏季節AFB1含量。因為黃曲霉毒素主要由寄生曲霉和產毒黃曲霉分泌產生的有毒次生代謝物，由于春夏季節和秋冬季節的溫差變化，造成酶的活性不同，并且黃曲霉菌生長繁殖及其在天然基質中產生黃曲霉毒素所需要的最低相對濕度為14%左右，所需最適宜的溫度為25～30 ℃[17]，水分含量超過10%，非常容易造成黃曲霉毒素的污染和毒素積累，所以在秋冬季節濕度和溫度較低，而在春夏季節濕度和溫度都較高，適應AFB1的生長，所以導致AFB1的含量有差異。可以得出季節對郫縣豆瓣中寄生曲霉和產毒黃曲霉分泌產生的黃曲霉毒素有一定的影響，食品安全監管應該把春夏季節作為檢查的重點，生產廠家也可以根據季節來控制減少AFB1的污染，給消費者帶來食品安全的保障[18]。

加強對AFB1的防治措施從兩個方面進行，一是預防，二是處理降低AFB1。預防郫縣豆瓣受污染的途徑應當包括生產豆瓣的原料、生產和存儲全過程；處理降低AFB1的方法有堿處理法、氧化處理法、吸附劑脫毒、高溫處理法、黃曲霉毒素生物降解、微生物代謝產物降解黃曲霉毒素[19]。而本研究通過對一整年豆瓣中AFB1污染情況的調查，比較春夏季節和秋冬季節豆瓣中AFB1含量的不同，分析了我市郫縣豆瓣在不同季節AFB1含量的總體狀況，為建立我市郫縣豆瓣中黃曲霉毒素B1的應急對策與預警體系提供了基礎數據，讓我們思考可以從不同的季節對豆瓣進行發酵生產，來降低AFB1的污染，也可以通過溫度來控制AFB1的產生，為我國對發酵豆瓣中防治AFB1提供新思路。