孜然超聲波輔助提取及其抗氧化性研究

薛文君，商飛飛，豆海港

(1.周口職業技術學院，河南 周口 466001；2.賀州學院 食品科學與工程技術研究院，廣西 賀州 542899)

孜然，學名CuminumcyminumL.，又名孜然芹、枯茗、香旱芹等，是傘形科(Umbelliferae)孜然芹屬(CuminumL.)植物，作為一種極其重要的香辛料，其廣泛應用于食品工業[1,2]。孜然籽中含有質量分數3%～5%的精油，成分主要有枯茗醛、桃金娘烯醛、α-萜品烯、β-蒎烯等[3]。孜然精油具有抑菌、殺蟲、降血糖及防癌抗癌等生物活性功能。國內對孜然精油的功能研究主要集中在抑菌、殺蟲等方面，國外則對孜然精油的藥理作用做了比較系統的研究[4,5]。

超聲波提取法的原理是超聲波產生的機械作用，使液體內部產生強的沖擊波和微射流，局部出現高溫、高壓，產生多重次級效應，從而加快體系的傳質和傳熱速度，加速細胞內有效物質的釋放、擴散和溶解[6]。由于超聲波輔助提取具有提取率高、活性成分損失少等優點，目前已被廣泛應用于動植物等天然原料中有效成分的提取[7,8]。本文以孜然為原料，采用超聲波輔助溶劑提取法，在單因素試驗的基礎上，利用響應面中的Box-Behnken試驗優化，同時對孜然提取物的抗氧化活性進行了初步研究，以期為孜然的開發利用提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

孜然籽：購于當地超市，置于(80±1)℃干燥箱中干燥6 h，經粉碎后過篩，備用。試劑DPPH：購于美國Sigma公司；其他試劑：均為分析純試劑。

1.2 主要儀器

XFB-500小型粉碎機、XD-52CS-1旋轉蒸發儀、HH-6電熱恒溫水浴鍋、KGD-1000S超聲波發生器、FA2104電子分析天平、UV-754 型分光光度計。

2 方法

2.1 單因素試驗

采用無水乙醇為提取劑，分別考察粉碎粒徑(mm)、提取時間(h)、料液比(g/mL)對孜然提取物得率的影響。

2.2 響應面優化孜然提取試驗

在單因素試驗基礎上，以粉碎粒徑(X1)、提取時間(X2)、料液比(X3)3個因素為自變量，以孜然提取物得率為響應值，采用響應面Box-Behnken(BBD)中心組合設計，進行3因素3水平的優化試驗，響應面分析因素和水平見表1。

表1 因素與水平編碼表

2.3 抗氧化能力的測定

2.3.1 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定，參考游玉明等[9]的方法，分別取100 μL不同質量濃度的孜然提取物及對照溶液加入0.08 mg/mL的DPPH甲醇溶液100 μL，搖勻后于室溫條件下避光靜置30 min，在517 nm波長處測定光密度值。以DPPH溶液和甲醇溶液為空白，按照式(1)計算樣品對DPPH自由基的清除能力。

(1)

2.3.2 ·OH清除能力的測定[10,11]

取l mL不同濃度的孜然提取物溶液于比色管中，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液l mL、6 mmol/L水楊酸乙醇溶液1 mL，加入8 mmol/L的H2O2反應，置于37 ℃水浴30 min后取出，在510 nm波長處測吸光度。以相同濃度維生素C為陽性對照，以蒸餾水做空白對照；重復試驗3次，取平均值。

(2)

式中：A1為樣品溶液+FeSO4溶液+水楊酸乙醇溶液+H2O2溶液的吸光度；A2為樣品溶液+FeSO4溶液+水楊酸乙醇溶液+無水乙醇溶液的吸光度；A3為蒸餾水+FeSO4溶液+水楊酸乙醇溶液+H2O2溶液的吸光度。

3 結果與討論

3.1 單因素試驗

3.1.1 粉碎粒徑對孜然提取物得率的影響

設定提取時間為1 h、料液比為1∶15 (g/mL)，分別在粉碎粒徑0.6，0.45，0.3，0.2 mm條件下進行提取試驗，以孜然提取物得率為指標，研究不同粉碎粒徑對孜然提取物得率的影響，結果見圖1。

圖1 粉碎粒徑對孜然提取物得率的影響

由圖1可知，在相同的條件下，隨著粉碎粒徑的減少，孜然提取物得率先升高后緩慢減小，這可能是由于粒徑的降低，促進物質的溶出，提高了得率，但當物料粒徑達到一定大小時，再增加物料粒徑可能使其表面能增加[12]，所以造成孜然提取物得率降低。當粉碎粒徑為0.3 mm時，孜然提取物得率達到最大值。

3.1.2 提取時間對孜然提取物得率的影響

設定粉碎粒徑為0.3 mm、料液比為1∶15 (g/mL)，分別在提取時間0.5，1.0，1.5，2.0 h下進行提取試驗，以孜然提取物得率為指標，研究不同提取時間對孜然提取物得率的影響，結果見圖2。

圖2 提取時間對孜然提取物得率的影響

由圖2可知，在相同的條件下，隨著提取時間的延長，孜然提取物得率先升高后緩慢減低，當提取時間為1.5 h時，孜然提取物得率達到最大值。

3.1.3 料液比對孜然提取物得率的影響

設定粉碎粒徑為0.3 mm、提取時間為1 h，按照料液比為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20 (g/mL)分別進行提取試驗，以孜然提取物得率為指標，研究料液比對孜然提取物得率的影響，結果見圖3。

圖3 料液比對孜然提取物得率的影響

由圖3可知，在相同的條件下，隨著料液比的增大，孜然提取物得率先緩慢升高后減低，當料液比為1∶15 (g/mL)時，孜然提取物得率達到最大值。

3.2 響應面法試驗

以孜然提取物得率為考核指標，對孜然超聲波輔助提取的工藝條件進行優化，響應面試驗設計及結果見表2。根據表2的有關數據，對孜然提取物得率進行統計分析，方差分析見表3。

表2 響應面試驗結果

續 表

表3 方差分析

由表3可知，相關系數R2為93.35%，回歸模型達到顯著水平(Pr=0.012252<0.05)，說明回歸模型的擬合度較好。通過SAS中RSRGE優化，可得出模型的回歸方程為：

Y=4.513333-0.005X1-0.04875X2-0.08125X3-0.357917X12+0.26X1X2-0.075X1X3- 0.260417X22+0.1775X2X3-0.400417X32。

通過方程求解，可求出孜然提取物得率最優工藝組合：粉碎粒徑為0.3 mm，提取時間為1.04 h，料液比為1∶12 (g/mL)。

為進一步分析雙因素對模型的影響，將其中1個因素固定在零水平，研究另外2個因素對孜然提取物得率的影響，趨勢圖見圖4。

圖4 趨勢圖

圖4中a表示將X3固定在零水平，由圖4中a可以看出，響應值均隨著X1和X2的增大先增大后減小；圖4中b表示將X2固定在零水平，由圖4中b可以看出，響應值隨著X1的增大先增大后減小；由圖4中c可以看出，響應值隨著X2的增大先增大后減小，隨著X3的增大先增大后減小。由圖4分析可以得出，趨勢圖中有一穩定點且為最大值。

根據響應面法優化試驗確定的工藝，對孜然提取物得率做了3次試驗，進行驗證，結果見表4。

表4 驗證結果

由表4可知，驗證試驗結果與響應面優化試驗結果相符合，說明響應面法優化孜然提取物工藝是合理的。

3.3 抗氧化活性

3.3.1 DPPH自由基清除作用

DPPH是最古老的間接測定方法，廣泛應用于測定天然抗氧化劑的自由基清除能力[13]，DPPH為穩定的自由基，溶于甲醇等極性溶劑中，DPPH自由基的清除是通過物質在反應中提供氫原子或電子來完成的。孜然提取物與BHT對DPPH自由基清除能力試驗結果見圖5。

圖5 孜然提取物與BHT對DPPH自由基清除能力

由圖5可知，隨著濃度的增加，DPPH的清除率呈逐漸增大的變化趨勢，孜然提取物對DPPH自由基清除率值都低于BHT，這種差異是由還原性物質的還原能力和濃度造成的，這些結構上的不同造成了抗氧化能力或其他生物活性的復雜變化。近來，研究表明孜然提取物[14]具有一定的自由基清除能力。

3.3.2 ·OH清除作用

孜然提取物與BHT對·OH清除能力試驗結果見圖6。

圖6 孜然提取物與BHT對·OH清除能力

由圖6可知，隨著樣品濃度增加，其對·OH的清除率也逐漸升高，當濃度達10 mg/mL時，孜然提取物對·OH的清除率最高，達75.6%。

4 結論

利用孜然超聲波輔助提取工藝的優化研究表明，孜然提取物的最佳工藝條件為：粉碎粒徑0.3 mm，提取時間1.04 h，料液比1∶12 (g/mL)，此時，孜然提取物的得率為4.51%。

孜然提取物對DPPH自由基及·OH抗氧化試驗表明，孜然提取物在濃度2～10 mg/mL范圍內，對DPPH自由基清除率及·OH清除率隨著提取物濃度的增加呈現逐漸增大的變化趨勢，濃度達10 mg/mL時，孜然提取物對·OH清除率為75.6%。