血必凈對哮喘小鼠氣道重塑及黏附分子ICAM-1、VCAM-1的影響

孫玉金，李來傳，史有奎，高名同，徐珊珊，陳京霞

（1.濰坊醫學院臨床醫學院，山東 濰坊261053；2.濰坊醫學院附屬醫院急診科，山東 濰坊261031）

哮喘是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。哮喘病理以氣道炎癥、氣道高反應性、氣道重塑為主要特征[1]。長期慢性氣道炎癥的刺激使氣道壁發生結構性的改變，稱為氣道重塑，主要表現為氣道上皮黏液化生、平滑肌肥大/增生、上皮下膠原沉積和纖維化、血管增生等[2-3]，從而使哮喘患者對吸入激素的敏感性降低，出現不可逆的氣流受限及持續存在的氣道高反應性[4]。細胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1）、血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）均為細胞表面產生的免疫球蛋白，炎癥反應時介導細胞與細胞間、細胞與血管內皮間的黏附，是炎癥反應形成的基礎[5]，因此ICAM-1、VCAM-1的水平可反映哮喘氣道炎癥水平。血必凈注射液是含有多種中藥成分的復方制劑，具有抗淤解毒、抗炎等作用，可通過不同機制調控炎癥反應[6-7]。本研究主要通過復制小鼠哮喘模型及血必凈注射液的干預，觀察血必凈哮喘小鼠肺泡灌洗液中ICAM-1、VCAM-1水平及氣道重塑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BABL/c小鼠40只，購自北京華阜康生物有限公司，使用許可號SYXK（魯）2013-001，實驗動物許可證號：SCXK（京）2014-0004，6～8周齡，體重16～20 g，飼養于濰坊醫學院動物房，室溫25℃，濕度50%，12 h黑白交替，標準飼料，自由取水。

1.2 藥物

血必凈，天津紅日藥業有限公司，10 ml/支。

1.3 主要試劑和儀器

卵清蛋白（OVA）干粉（北京索萊寶科技有限公司），水合氯醛、PBS緩沖液、4%多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司），氫氧化鋁（天津博迪化工股份有限公司），ICAM-1 ELISA試劑盒、VCAM-1 ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），霧化器（boy037G 6000型，Pari德國），霧化箱（自制，20 cm×20 cm×20 cm），20 ml注射器（威高集團有限公司），HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.4 分組與模型復制

將小鼠隨機分成5組：健康對照組（C組）、慢性哮喘組（A組）、血必凈干預1周組（1組）、血必凈干預2周組（2組）和血必凈干預3周組（3組），每組8只。除對照組之外，每組小鼠均于第1、8、15天分別注射卵清蛋白混懸液OVA[含100 μg OVA，1 mg Al（OH）3]致敏，對照組用等量生理鹽水注射；從第22天開始將小鼠放入自制的霧化箱內，除對照組外其余各組小鼠每天霧化吸入1%的OVA 15 min激發，每天吸入1次，時間20 min，霧化至第56天，小鼠出現煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁、毛發聳立、活動與飲食減少等癥狀為模型復制成功，復制模型總時間為8周。對照組給予相同劑量生理鹽水霧化吸入；1、2、3組從第57天開始腹腔注射血必凈注射液4 ml/（kg·d），治療時間分別為1、2、3周。

1.5 肺泡灌洗液的獲取與檢測

每只小鼠均于末次治療結束24 h后以6%水合氯醛（6 ml/kg）麻醉后處死，氣管切開，以20 ml針頭作為留置針，以BPS緩沖液行全肺灌洗，回收率為80%及以上。回收的肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）立即于3 000 r/min離心7 min，取其上清液，編號后置于-80℃冰箱冷凍保存待用。

1.6 肺組織的獲取與染色

收集完BALF之后立即取肺組織，左肺葉置于-80℃液氮中保存備用。右葉肺用4%的多聚甲醛固定并用石蠟包埋，制成5 μm厚切片，分別按照HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒操作說明書進行染色。

1.7 肺泡灌洗液ICAM-1、VCAM-1的檢測

取BALF上清液以酶聯免疫吸附實驗（enzymelinked immuno sorbent assay,ELISA）法嚴格按照ICAM-1 ELISA試劑盒、VCAM-1 ELISA試劑盒的說明書操作，用酶聯儀在450 nm波長處測吸光度值，ICAM-1、VCAM-1的濃度與吸光度值成正比，通過繪制標準曲線求出標本中ICAM-1、VCAM-1的濃度。

1.8 肺組織形態學分析

病理形態學：肺組織Masson染色顯示小鼠氣道上皮下膠原纖維沉積情況，染色成淡藍色，HE染色可觀察肺組織炎癥細胞浸潤程度及支氣管腔分泌物、黏膜褶皺水腫、氣道平滑肌及基底膜情況。氣道形態學：應用Image Pro Pluse圖像分析軟件測定支氣管基底膜周徑（Pbm）、支氣管管壁面積（WAt）、支氣管平滑肌面積（WAm），并用Pbm標化，WAt/Pbm表示支氣管管壁厚度，以WAm/Pbm表示支氣管平滑肌厚度。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組BALF中ICAM-1、VCAM-1水平比較

各組BALF中ICAM-1、VCAM-1水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；A組ICAM-1、VCAM-1的水平高于其余4組（P＜0.05），說明該模型復制成功；1組、2組、3組隨著血必凈干預時間延長，ICAM-1和VCAM-1的水平逐漸下調，但均高于C組（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組肺組織形態比較

與C組比較，Masson染色可見A組氣道上皮下膠原纖維沉積增多，血必凈干預的1組、2組、3組隨著干預時間延長，氣道上皮下膠原纖維沉積逐漸減少（見圖1A）；HE染色可見C組氣道壁光滑連續、無皺褶水腫，氣道管壁無明顯增厚，炎癥細胞浸潤少，A組與C組比較，氣道壁不連續，黏膜皺褶水腫增多，氣道平滑肌及基底膜明顯增厚，氣道壁周圍炎癥細胞浸潤，支氣管腔分泌物增多，1組、2組、3組隨著血必凈干預時間延長，上述組織病理變化好轉（見圖1B）。

2.3 各組肺組織支氣管管壁厚度及平滑肌厚度比較

各組肺組織支氣管管壁厚度及平滑肌厚度比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；A組支氣管管壁厚度、平滑肌厚度厚于其余4組（P＜0.05）；1組、2組、3組支氣管管壁厚度、平滑肌厚度逐漸變薄，但均厚于C組（P＜0.05）。見表2和圖2。

表1 各組BALF中ICAM-1、VCAM-1水平比較（n=8，pg/ml，±s）

表1 各組BALF中ICAM-1、VCAM-1水平比較（n=8，pg/ml，±s）

注：1）與 A組比較，P＜0.05；2）與C組比較，P＜0.05；3）與1組比較，P＜0.05；4）與2組比較，P＜0.05

組別 ICAM-1 VCAM-1 C組 274.14±39.151） 131.80±50.881）A組 681.85±80.512） 565.27±89.612）1 組 597.43±94.041）2） 456.71±66.801）2）2 組 466.25±82.251）2）3） 343.00±66.801）2）3）3 組 349.29±36.031）2）3）4） 259.54±75.111）2）3）4）F值 45.742 45.095 P值 0.000 0.000

圖1 各組肺組織形態比較

表2 各組肺組織支氣管管壁厚度及平滑肌厚度比較（n=8，μm，±s）

表2 各組肺組織支氣管管壁厚度及平滑肌厚度比較（n=8，μm，±s）

注：1）與 A 組比較，P＜0.05；2）與 C 組比較，P＜0.05；3）與1組比較，P＜0.05；4）與2組比較，P＜0.05

組別 支氣管管壁厚度 平滑肌厚度C組 9.93±0.451） 4.33±0.131）A組 18.94±0.402） 7.06±0.282）1 組 16.97±0.151）2） 5.97±0.221）2）2 組 14.11±0.281）2）3） 5.10±0.131）2）3）3 組 11.91±0.191）2）3）4） 4.89±0.071）2）3）4）F值 1067.595 279.109 P值 0.000 0.000

圖2 各組肺組織支氣管管壁厚度及平滑肌厚度比較

3 討論

哮喘在我國的發病率為0.7%～3.8%[8]，是最常見的慢性疾病之一，有研究指出其死亡率占全球總死亡率的1/250[9]，且其發病率及死亡率呈逐年增加的趨勢[10]。

哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的2個重要的病理特征。持續存在的氣道炎癥是導致氣道重塑的主要原因，而氣道重塑又會使患者對吸入激素的敏感性降低，出現不可逆的氣流受限及持續存在的氣道高反應性，也是難治性哮喘死亡率增高的主要原因之一[4]。ICAM-1、VCAM-1均為細胞表面產生的免疫球蛋白，炎癥反應時介導細胞與細胞間、細胞與血管內皮間的黏附，是炎癥反應形成的基礎[5]。VCAM-1主要在內皮細胞上表達，可介導內皮細胞與白細胞的黏附。ICAM-1主要分布于白細胞、內皮細胞、平滑肌細胞上，主要介導單核細胞、淋巴細胞、中性粒細胞與內皮細胞黏附，促進淋巴細胞聚集。ICAM-1、VCAM-1還可促進氣道炎癥時嗜酸性粒細胞的跨膜轉移[11]。因此，若能使黏附分子ICAM-1、VCAM-1的水平降低，減少炎癥細胞的黏附和跨內膜遷移[12]，可有效減輕氣道炎癥，從而減輕因長期氣道炎癥引起的氣道重構。從而從根本上提高哮喘患者的生活質量，甚至治愈哮喘。

現在臨床治療中以糖皮質激素和支氣管擴張劑為主，佐以免疫調節藥物，側重于緩解支氣管哮喘的急性發作，但是針對氣道重塑的藥物卻很少[1，3]。并且糖皮質激素還可以引起高血壓、高血糖、高脂血癥、骨質疏松癥等不良反應[13-14]，臨床中還發現有些哮喘患者對糖皮質激素并不敏感[15-17]，每每遇到上述情況，臨床治療就會受到很大限制，因此尋找一種新型有效的治療哮喘的藥物正日益引起人們的關注。

血必凈是一種中藥復方制劑，由中藥紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸組成，具有活血化瘀、疏通脈絡、潰散毒邪、消除內毒素的功能，還具有擴張血管、改善微循環和組織灌注的作用尤其適用于因感染誘發的全身炎癥反應的疾病，現有研究表明血必凈可通過抑制炎癥介質的釋放，減少炎癥反應[18-19]。有研究提出血必凈可有效改善外周血中性粒細胞的趨化[7]，但未做進一步研究。本研究通過5組小鼠的比較發現血必凈可使哮喘小鼠BALF中黏附分子ICAM-1、VCAM-1水平下降，且干預時間越長，下降水平越顯著，從而有效減輕哮喘的炎癥反應。通過鏡下觀察及相關醫學圖像分析軟件測定證實血必凈可有效改善哮喘患者的氣道重塑。因此大膽推測血必凈或許會成為治療哮喘的新藥物，這為哮喘治療提供了新思路。