冠心病患者外周血中EMMPRIN表達量與斑塊特征、基質金屬蛋白酶含量的關系研究

趙玉軍，李波

（1.山東省淄博市第一醫院 心內一科，山東 淄博 255200；2.山東省淄博市中心醫院心內二科，山東 淄博 255036）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心?。┦桥R床上最常見的心血管系統疾病之一，冠狀動脈粥樣斑塊形成、管腔狹窄是冠心病的病理基礎。冠心病患者中穩定型心絞痛的斑塊性質穩定、臨床癥狀較輕，急性冠狀動脈綜合征患者的斑塊性質不穩定、斑塊破裂會造成冠狀動脈內血栓形成并引起心肌發生缺血缺氧性損傷。目前，引起動脈粥樣斑塊性質改變的關鍵分子尚未明確。細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN）是近年來新發現的免疫球蛋白超家族成員，已有離體研究證實EMMPRIN與基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）的表達具有相關性并且能夠影響粥樣斑塊的性質[1-2]。但是，關于冠心病患者體內EMMPRIN的表達量及其與粥樣斑塊性質、MMPs含量的關系尚不明確。在下列研究中，筆者分析了冠心病患者外周血中EMMPRIN表達量與斑塊特征、基質金屬蛋白酶含量的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013年6月-2015年10月在山東省淄博市第一醫院確診為穩定型心絞痛（stable angina pectoris,SAP）的69例患者和急性冠狀動脈綜合征（acute cornary syndromes,ACS）的47例患者作為研究對象。納入標準：①經冠狀動脈造影明確存在主要冠狀動脈直徑狹窄超過50%，確診為冠心??；②符合美國心臟病學學會SAP和ACS的診斷標準；③病歷資料完整、血液標本均已留取。排除標準：①合并惡性腫瘤的患者；②合并慢性肝臟疾病和肝纖維化的患者；③合并慢性腎臟疾病的患者；④合并糖尿病的患者。選擇同期在本院體檢的57例健康志愿者作為研究的對照組，均無心腦血管疾病病史。SAP組中男性42例，女性27例，年齡（51.3±6.6）歲；ACS組中男性29例，女性18例，年齡（50.4±6.2）歲；對照組中男性35例，女性22例，年齡（49.7±6.1）歲。3組受試者一般資料的比較差異無統計學意義。

1.2 斑塊性質的評估方法

采用64層螺旋CT掃描機進行冠狀動脈成像檢查，方法如下：經右側肘靜脈以5.0 ml/s的速度注射碘海醇50～60 ml，完成后以相同速度注射生理鹽水40 ml，囑患者吸氣后屏氣，從氣管分叉到肝臟上緣進行掃描。獲取三維重建圖像后對冠狀動脈粥樣斑塊的CT值進行測量，按照下列方法判斷斑塊性質：CT值＜60 HU為軟斑塊、CT值60～129 HU為纖維斑塊、CT值≥130 HU為鈣化斑塊。

1.3 外周血中EMMPRIN表達量的檢測方法

冠狀動脈成像檢查前采集外周靜脈血3 ml，枸櫞酸鈉抗凝后加入淋巴細胞分離液、密度梯度離心后分離外周血單個核細胞，用流式細胞儀檢測液重懸細胞并調節密度值1×106個/L，而后分別賦予PE標記的CD14熒光抗體、FITC標記的EMMPRIN熒光抗體，20 min后用PBS緩沖液洗滌、離心2遍，最后在流式細胞儀上測定外周血單個核細胞表面EMMPRIN的平均熒光強度。

1.4 血清中MMPs含量的檢測方法

冠狀動脈成像檢查前采集外周靜脈血3 ml，室溫靜置20 min后在離心機中3 000 r/min離心10 min，分離血清后采用酶聯免疫吸附試劑盒測定血清中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14的含量。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間分析采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，相關性采用Pearson檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組外周血單個核細胞表面EMMPRIN的表達量及血清中MMP的含量比較

3組外周血單個核細胞表面EMMPRIN的平均熒光強度以及血清中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14的含量，經單因素方差分析，差異有統計學 意 義（F=10.382、7.086、9.494、17.594、12.373和14.451，均P=0.000）。進一步兩兩比較顯示，與對照組比較，SAP組外周血單個核細胞表面EMMPRIN的平均熒光強度以及血清中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14的含量均增高（t=10.382、7.086、9.494、17.594、12.373 和 14.451，均P=0.000），ACS組外周血單個核細胞表面EMMPRIN的平均熒光強度以及血清中 MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14的含量均增高（t=16.731、10.362、12.781、21.385、15.589和17.448，均P=0.000）；與SAP組比較，ACS組外周血單個核細胞表面EMMPRIN的平均熒光強度以及血清中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14的含量均增高（t=12.351、9.262、8.385、15.132、11.782 和 13.672，均P=0.000）。見表1。

2.2 SAP組和ASC組患者中不同斑塊類型與外周血單個核細胞表面EMMPRIN表達量、血清中MMP含量的關系

SAP組和ASC組中軟斑塊、纖維斑塊、鈣化斑塊患者外周血單個核細胞表面EMMPRIN的平均熒光強度以及血清中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14的含量，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=8.935、7.767、12.585、15.485、13.472和17.680，均P=0.000）。進一步兩兩比較顯示，與鈣化斑塊患者比較，纖維斑塊患者外周血單個核細胞表面EMMPRIN的平均熒光強度以及血清中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14 的 含量均增高（t=7.521、6.624、8.523、12.452、9.521和11.365，均P=0.000），軟斑塊患者外周血單個核細胞表面EMMPRIN的平均熒光強度以及血清中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14的含量均增高（t=13.352、8.362、8.523、14.785、11.385和 13.929，均P=0.000）；與纖維斑塊患者比較，軟斑塊患者外周血單個核細胞表面EMMPRIN的平均熒光強度以及血清 中 MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14的含量均增高（t=11.781、9.982、12.378、12.152、12.352和 10.523，均P=0.000）。見表2。

2.3 EMMPRIN表達量與MMP含量的相關性

Pearson檢驗顯示，外周血單個核細胞表面EMMPRIN的熒光強度與血清中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14的含量呈正相關（r=0.752、0.592、0.661、0.703 和 0.638，P=0.005、0.007、0.002、0.009和 0.008）。

表1 3組EMMPRIN表達量及MMP含量比較 （±s）

表1 3組EMMPRIN表達量及MMP含量比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與SAP組比較，P ＜0.05

組別 EMMPRIN/（MFI） MMP-1/（ng/ml） MMP-2/（ng/ml） MMP-3/（ng/ml） MMP-9/（ng/ml） MMP-14/（ng/ml）SAP組（n=69） 9.34±0.951） 1.03±0.131） 203.46±26.711） 93.42±10.341） 263.45±31.351） 89.54±10.341）ACS 組（n=47） 13.54±1.921）2） 1.76±0.221）2） 334.54±42.581）2） 175.75±22.411）2） 436.54±56.711）2） 142.32±15.591）2）對照組（n=57） 5.57±0.67 0.58±0.08 142.36±17.65 53.67±7.86 176.88±22.52 38.79±5.52 F值 10.382 7.086 9.494 17.594 12.373 14.451 P值 0.000 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 不同斑塊類型患者的EMMPRIN表達量及MMP含量比較 （±s）

表2 不同斑塊類型患者的EMMPRIN表達量及MMP含量比較 （±s）

注：1）與鈣化斑塊患者比較，P ＜0.05；2）與纖維斑塊患者比較，P ＜0.05

斑塊類型 EMMPRIN/（MFI） MMP-1/（ng/ml） MMP-2/（ng/ml） MMP-3/（ng/ml） MMP-9/（ng/ml） MMP-14/（ng/ml）軟斑塊 16.79±2.231）2） 1.95±0.241）2） 394.12±53.521）2） 215.54±25.781）2） 513.42±65.681）2） 193.54±22.341）2）纖維斑塊 11.04±1.581） 1.34±0.171） 274.59±35.231） 143.12±15.581） 332.57±42.691） 104.31±13.171）鈣化斑塊 8.63±0.93 0.91±0.12 175.38±22.15 80.48±7.78 234.51±29.51 69.36±8.35 F值 8.935 7.767 12.585 15.485 13.472 17.680 P值 0.001 0.005 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

EMMPRIN是近年來新發現的一類高糖基化跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，是MMPs分子表達的上游調控因子。近年來，MMPs表達異常與心腦血管疾病、動脈粥樣硬化的關系受到了越來越多的重視，多種MMP分子被證實能夠造成動脈粥樣斑塊纖維帽降解、引起斑塊性質改變及斑塊破裂，加速冠心病的病理進程并增加心肌梗死的發生風險[3-4]。與動脈粥樣斑塊性質改變有關的MMP分子眾多，但是引起多種MMPs分子含量改變的上游機制卻仍未明確，EMMPRIN是否通過調節MMPs的表達來參與冠心病的發生和發展也尚未得到證實。本研究通過分析SAP患者和ACS患者外周血中EMMPRIN的表達量發現，SAP組和ACS組外周血單個核細胞表面EMMPRIN的熒光強度高于對照組且ACS組外周血中EMMPRIN的熒光強度高于SAP組。這就說明外周血中EMMPRIN的高表達參與了冠心病病情的發生和發展，在SAP患者和ACS患者體內均發現EMMPRIN表達上調；并且在SAP發展為ACS的過程中，EMMPRIN的表達進一步增多。

動脈粥樣硬化是冠心病患者最基本的病理變化，冠狀動脈內粥樣斑塊形成會造成管腔狹窄、血供減少，進而出現心肌缺血的臨床癥狀和體征。粥樣斑塊的性質是決定冠心病病情嚴重程度的關鍵病理因素，SAP患者的粥樣斑塊穩定、患者僅在過度勞累后出現心絞痛的癥狀；ACS患者的粥樣斑塊性質不穩定、纖維帽較薄甚至破裂，冠狀動脈內血栓形成并且會造成心肌發生缺血性壞死。為明確SAP患者和ACS患者外周血中EMMPRIN表達量改變與冠狀動脈粥樣斑塊性質變化的關系，本課題組通過冠狀動脈CT成像對斑塊性質進行判斷并分析不同斑塊性質對EMMPRIN表達量的影響。鈣化斑塊、纖維斑塊以及軟斑塊的CT值呈逐步增加趨勢[5-6]，外周血單個核細胞表面EMMPRIN的熒光強度呈現出軟斑塊＞纖維斑塊＞鈣化斑塊的趨勢。表明SAP患者和ACS患者外周血中EMMPRIN表達量的改變與冠狀動脈斑塊性質的改變有關，EMMPRIN表達量越高、斑塊性質越不穩定，患者發生斑塊破裂以及心肌缺血性壞死的風險也隨之增大。

近年來關于EMMPRIN功能的研究主要集中在腫瘤學，多項研究證實[7-8]，EMMPRIN能夠增加多種惡性腫瘤細胞中MMPs的表達、促進細細胞外基質及基底膜的降低。在心腦血管疾病領域，SCHULZ[1]的研究證實，EMMPRIN和MMP-9均在頸動脈粥樣斑塊的纖維帽結構中高表達且兩者高表達的區域較為一致。但是，冠心病患者體內受到EMMPRIN調控的MMPs分子種類并不明確。MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14是目前已經證實與冠狀動脈粥樣硬化病理進程相關的MMPs分子，對粥樣斑塊纖維帽中的細胞外基質具有水解作用，能夠造成纖維帽變薄并增加斑塊破裂的風險[9-12]。本課題組通過對血清中上述MMPs分子含量的分析發現，SAP組和ACS組患者的血 清 MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14含量均升高，且斑塊性質越不穩定血清中上述MMPs分子的含量越高。為明確冠心病患者體內EMMPRIN對MMPs表達的調控作用，本研究分析EMMPRIN表達量與MMPs的相關性，結果顯示，外周血單個核細胞表面EMMPRIN的熒光強度與血清中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14的含量呈正相關。這就說明冠心病患者體內高表達的EMMPRIN參與了MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-14生成增多的過程。

綜上所述，冠心病患者外周血中EMMPRIN表達量上調與粥樣斑塊性質不穩定、MMPs含量增加有關。