佐劑性關節炎大鼠血小板微粒、血小板參數及滑膜組織的變化

劉磊，劉健，黃傳兵，萬磊，諶曦

(安徽中醫藥大學第一附屬醫院風濕病科，合肥 230031)

類風濕關節炎(RA)是一種可致多系統受累的、慢性、侵襲性自身免疫性疾病，以關節滑膜慢性炎癥為基本病理特征。滑膜組織血管增生形成血管翳對關節軟骨的侵蝕，是造成RA關節功能障礙的最主要原因。近年來血小板參數及血小板微粒的異常表達[1-2]、促血管生長因子/抑制血管生長因子的表達失衡[3-4]成為RA關節病變發病機制研究的熱點。本研究通過觀察AA大鼠外周血血小板微顆粒(PMPs)、血小板參數(PLT、PCT、PDW、MPV)、滑膜組織血管內皮生長因子(VEGF)、內皮抑素(ES)及滑膜微血管密度(MVD)的變化，以探討PMPs、血小板參數及VEGF、ES在RA病變中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及飼喂 雄性清潔級SD大鼠24只，購于安徽省實驗動物中心[動物許可證號：SYXK(皖)2015-06]，大鼠體質量(200±20) g，飼喂于安徽中醫藥大學實驗中心動物房，動物房環境保持安靜，溫度18～26℃，相對濕度40%～70%，保持通風排氣10～20 次/小時。

1.2 試劑 弗氏完全佐劑購自美國Sigma公司；CD31檢測試劑盒、SP試劑盒和DAB試劑免疫組織化學染色試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司；Trizol購自INVITROGEN公司提供(批號：15596-026)；逆轉錄試劑盒購自美國Thermo公司(批號：K1622)；熒光定量試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司(批號：CW0956)；引物由INVITROGEN公司合成；藻紅蛋白(PE)標記的CD41、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD61抗體購自美國Biolegend公司，批號為B188064、B181084。標準熒光微珠購自美國Sigma公司，yellow-green 1um，批號：MKBT2841V。

1.3 主要儀器 足趾容積測量儀：北京吉安得爾科技有限公司，型號：YLS-7B；電子天平：上海力衡儀器儀表有限公司，型號 MXX-5001；Sysmex XT-2000i 全自動血細胞分析儀器；組織石蠟包埋機：德國徠卡(LEICA)公司，型號：A130395；石蠟切片機：德國LEICA公司，型號：RM2245；組織脫水機：德國LEICA公司，型號：ASP300S；漂片機：美國伯明斯頓(Bloomington)公司，型號：MP-220；烘片機：德國LEICA公司，型號：HI1220；染色機:德國賽利(SLEE)公司，型號：MAS。顯微鏡：日本奧林巴斯 (OLYMPUS)公司，型號：T-Gradient Thermoblock 96 PCR擴增儀：德國Biometra公司；Epics XL 型流式細胞儀:美國Beckman-coulter公司。

1.4 方法

1.4.1 模型復制及指標檢測 大鼠適應性飼養7 d后，按照隨機數字表法分為健康對照(NC)組、模型對照(MC)組，每組12只。向模型組大鼠右后足跖皮內注射弗氏完全佐劑致炎，注射量為0.1 mL/100 g，制成佐劑性關節炎(AA)模型。致炎后30 d用10%的水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉，無菌環境下取大鼠膝關節滑膜組織，免疫組織化學法檢測滑膜組織CD31表達計算滑膜MVD值、PCR法檢測滑膜組織VEGF mRNA、ESmRNA表達；取外周血流式細胞術檢測血小板微粒表達。

1.4.2 足趾腫脹度、關節炎指數測定 足趾腫脹度(E)：分別在模型復制前1天、致炎后30天測量各組大鼠足跖容積，計算各組大鼠足跖腫脹度。足跖腫脹度[5]=(Vt-Vn)/Vn×100%(Vn、Vt分別代表致炎前后足跖容積)。

關節炎指數(AI)：致炎后第30天觀察并記錄全身關節病變程度，根據未注射佐劑的其余3只肢體的病變程度累積積分，計算出各組大鼠AI。0分:無紅腫;1分:小趾關節紅腫;2分:趾關節和足跖腫脹;3分:踝關節以下的足爪腫脹;4分:包括踝關節在內的全部足爪腫脹[6]。把各個關節的積分累計起來,即為每只大鼠的AI分值。

1.4.3 大鼠滑膜JPI、MVD、ES、VEGF的檢測 關節病理損傷指數(JPI)評定：末次用藥24 h后將動物處死，切開大鼠右側足趾關節。各組大鼠取后足遠端趾間關節，用4%多聚甲醛固定24 h后，10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣5周；脫鈣完全后，石蠟包埋，切片，HE染色。采用HE染色方法進行分級評定[7]。即為每只大鼠的JPI值。

MVD的檢測：末次用藥24 h后將動物處死，無菌環境取膝關節滑膜組織，固定、包埋、切片后行免疫組織化學學染色。CD31抗體按1∶100稀釋，顯色后封片，以細胞胞漿或胞核中出現黃色或棕褐色顆粒為陽性反應。免疫組織化學染色的半定量判定：采用圖像分析軟件(美國Image-Pro Plus專業圖像分析軟件系統,美國Media Cybernetics公司)進行圖像分析,按照Weidner的方法[8]進行著色的微血管計數即為微血管密度(MVD)值。

滑膜VEGF、ES mRNA檢測：PCR法檢測大鼠滑膜ES、VEGF的表達。取大鼠滑膜組織用勻漿器勻漿，用Trizol試劑盒提取總RNA按照M-Mulv反轉錄試劑盒說明書提供的方法進行反轉錄。引物序列：VEGF序列：Forward 5′-CGG TTC CAG AAG GGA GAG GA -3′，Reverse 5′- CTG GGA CCA CTT GGC ATG G-3′；ES 序列Forward 5′- CGG GTC ATG CGG ACA GTTC GC-3′，Reverse 5′-CCG GAC TGT TCG GCT GAG GT-3′；采用實時熒光定量PCR法進行mRNA表達量分析，數據分析計算方法為 2-△△Ct，計算目的基因相對表達量。

1.4.4 外周血血小板參數、血小板微粒的檢測 血小板參數的檢測：采用Sysmex XT-2000i 全自動血細胞分析儀器檢測大鼠血小板參數。

血小板微粒的檢測：末次用藥24 h后，腹腔注射10%水合氯醛溶液(0.35 mL/100 g)麻醉，打開腹腔，行腹主動脈采血2 mL，以枸櫞酸鈉抗凝，800 r/min室溫離心20 min，分離血漿，上層液為富血小板血漿(PFP)，每管取PFP 50 μL，加入1 μL標準熒光微珠，CD61-FICT和CD41-PE各5 μL，加樣后室溫避光孵育30 min，使熒光單抗與血小板微粒特異性結合，檢測前用PBS溶液將容積調整至0.5 mL，上機檢測前取0.5 mL PBS中加入1 μL標準熒光微球以直徑1 μm標準熒光微球進行定位對照及設門，對門內顆粒(微顆粒直徑在0～1 μm) 進行分析，CD61-FITC和CD41-PE雙陽性顆粒為PMPs。結果經FACSAria流式細胞儀FlowJo軟件進行分析后輸出。

2 結果

2.1 AA大鼠外周血PMPs及血小板參數的變化 與NC組比較，MC組PMPs、血小板參數PLT、PCT明顯升高(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 AA大鼠外周血CD61+CD41+PMPs的表達

2.2 各組大鼠足趾腫脹度、關節炎指數的變化 致炎30天，與NC組相比較，MC組大鼠E、AI顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠足趾腫脹度、關節炎指數的變化

2.3 各組大鼠JPI、MVD、VEGF、ES的變化 與NC組相比較，MC組大鼠JPI、MVD顯著升高，滑膜VEGF mRNA顯著升高，滑膜ES mRNA顯著降低，VEGF mRNA /ES mRNA顯著升高。見表3及圖2。

表1 AA大鼠外周血PMPs及血小板參數的變化

注：AA為佐劑性關節炎，PMPs為血小板微粒，下表同

表3 各組大鼠JPI、MVD、VEGF、ES的變化

注：JPI為關節病理損傷指數，MVD為微血管密度，VEGF為血管內皮生長因子，ES為內皮抑素

圖2 滑膜組織病理、CD31的表達及VEGF、ES溶解曲線

2.4 各組大鼠PMPs與實驗指標的相關性分析 Spearman相關性分析結果表明，CD61+CD41+PMPs(%)與血小板參數PLT、PCT呈正相關；CD61+CD41+PMPs(%)與E、AI及JPI、MVD、VEGF mRNA、VEGF mRNA/ES mRNA呈正相關；血小板參數PLT與足趾腫脹度、MVD呈正相關；血小板參數PCT與E、AI呈正相關(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血小板微粒與實驗指標相關性分析

注：表中為r值，aP<0.05

3 討論

RA滑膜組織血管新生、血管翳的形成，可破壞關節軟骨面，導致關節功能障礙。有研究發現RA血小板細胞的異常變化與RA疾病活動密切相關[9-10]。傳統的觀點認為血小板活化、聚集可發揮凝血、止血、參與炎性反應等作用，而最近的研究表明血小板活化后可通過分泌PMPs參與免疫調節、血管新生[10-11]等重要生理病理學進程。而在RA的滑膜病變中，血管新生相關生長因子的表達失衡尤為顯著。血小板活化及血小板微顆粒表達異常、血管生長因子的分泌失衡，可誘發一系列免疫平衡的紊亂引起滑膜血管增生。

佐劑性關節炎大鼠模型是現在較為認可的RA動物模型，弗氏完全佐劑造模后，動物關節的持續、慢性病變與人RA病變相類似。本研究觀察到AA大鼠滑膜組織CD31表達顯著升高，MVD明顯上調，表明AA大鼠滑膜組織出現血管增生及血管翳的形成。同時本研究發現模型組大鼠滑膜VEGF mRNA顯著升高，滑膜VEGF mRNA顯著降低，VEGF mRNA /ES mRNA顯著升高，提示AA大鼠滑膜組織的微血管增生與VEGF的表達升高，ES表達降低及VEGF/ES的表達升高有關。

促血管生長因子/抑制血管生長因子失衡是RA血管增生的重要因素[12]。在多種以血管病理性增生為發病特征的疾病中VEGF與ES之間的表達失衡被認為是誘導血管增生的發病機制之一[13-14]。VEGF可磷酸化胞內酪氨酸殘基，誘發內皮細胞周圍局部基底膜分解。在缺氧環境下VEGF可增加血管通透性，調控血管內皮細胞形成血管芽誘導血管新生[15]。ES是已知研究發現的最有力的內源性血管生成抑制因子，可抑制內皮細胞增殖、降低遷移及血管芽成管，誘導內皮細胞凋亡進發揮抗血管新生作用[16-17]。本研究中AA大鼠滑膜VEGF表達升高，ES表達降低，表明AA大鼠滑膜組織促血管生長因子/抑制血管生長因子狀態失衡，進而促進了內皮細胞增殖，導致滑膜血管增生。

相關性分析表明PMPs與血小板參數PLT、PCT存在正相關；前期的研究證明AA大鼠存在血小板參數(PLT、PCT)及血小板活化因子(PAF)的異常升高，表明AA大鼠存在血小板異常活化[10-18]。本次研究中AA大鼠血小板參數(PLT、PCT)及PMPs表達率CD61+CD41+PMP%顯著高表達，表明AA大鼠血小板活化后血小板微粒釋放增多。進一步的研究表明CD61+CD41+PMPs與E、AI、MVD、VEGF mRNA、VEGF mRNA/ ES mRNA呈正相關，提示PMPs的高表達導致AA滑膜組織VEGF/ES的平衡失衡。

PMPs是血小板細胞在活化后細胞膜向外伸展變形以出芽方式形成囊泡而釋放或偽足斷裂脫落進入微循環所形成的小囊泡，其直徑一般小于1 μm[19]。PMPs具有整套的血小板膜蛋白和膜脂質等結構，其膜表面可表達血小板膜糖蛋白、血小板活化因子、粘附分子、整合蛋白等。有研究表明血小板微粒PMPs可促進血管內皮生長因子分泌增多[20]。而在多種血管病理性增生疾病中PMPs均存在異常表達[21-23]。因此AA大鼠PMPs表達升高可上調VEGF表達，導致促血管生成因子VEGF/抑制血管生成抑制ES平衡失衡，誘導滑膜組織血管新生及關節損傷。