CCK—8法在淋巴細胞增殖檢測中最佳實驗條件的篩選

王瑾 馬肖容 張王剛

[摘要] 目的 篩選CCK-8法在淋巴細胞增殖檢測中的最佳實驗條件。 方法 采用正交實驗設計，對初始細胞濃度、培養時間、LPS濃度、顯色時間這4個主要因素各水平對人外周血單個核細胞（PBMC）和小鼠脾細胞增殖的影響進行試驗研究，對各實驗組合測得的刺激指數進行方差分析。 結果 CCK-8檢測人PBMC增殖試驗的最佳條件：初始細胞濃度為2.5×106/mL，培養時間為48 h，LPS濃度為1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h；檢測小鼠脾細胞增殖試驗的最佳條件：初始細胞濃度為5.0×106/mL，培養時間為48 h，LPS濃度為1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h。 結論 CCK-8法便捷、靈敏、重復性好，可作為檢測淋巴細胞增殖的穩定方法。本研究建立的CCK-8最佳實驗條件可為免疫調節作用的藥物體外篩選和免疫藥理學作用的研究提供依據。

[關鍵詞] CCK-8；PBMC；淋巴細胞增殖；正交實驗

[中圖分類號] R392.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）08（b）-0013-04

[Abstract] Objective To optimize the experimental conditions of CCK-8 in lymphocyte proliferation assays. Methods An orthogonal test was designed to investigate the influence of four major factors （cell density， culture period， concentration of LPS and duration of incubation with CCK-8） on cell proliferation of human PBMC and mouse splenocyte. ANOVA was carried out to analyze the stimulation indices of all experimental condition combinations. Results The optimal conditions for CCK-8 was as follows： for PBMC， cell density was 2.5×106/mL， culture period was 48 h， concentration of LPS was 1 μg/mL， and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h； and for splenocyte， cell density was 5.0×106/mL， culture period was 48 h， concentration of LPS was 1 μg/mL， and duration of incubation with CCK-8 was 4.5 h. Conclusion The optimized CCK-8 protocol is a sensitive， convenient and stable quantitative method to evaluate lymphocyte proliferation. This result can provide evidence in screening of immunomodulating drugs and investigation of their immunopharmacology.

[Key words] CCK-8； PBMC； Lymphocyte proliferation； Orthogonal test

檢測淋巴細胞增殖的方法主要有形態學檢查法、放射性核素標記法和四氮唑鹽比色法等。形態學檢查法和放射性核素標記法因多方面原因應用有限。MTT比色法以其快速簡便、靈敏度高、無放射性污染等特點，已經成為細胞生物學及相關領域分析細胞生長、活性的基本方法[1]。但其形成的甲臜結晶（Formazan）不溶于水，需加有機溶劑溶解，重復性不佳。近年來國外開發了多種水溶性的四氮唑鹽類，如MTS[2]、XTT和WST-8[3-4]等。CCK-8試劑中含有的WST-8可被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臢，減少了實驗步驟，提高了實驗結果的準確性[5]。生成的甲臢數量與活細胞的數量成正比。用酶標儀在450 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量，用于分析細胞增殖和活性[6-7]。本研究采用正交實驗設計對CCK-8檢測法的實驗條件進行探討，以期建立人外周血單個核細胞（human peripheral blood mononuclear cells，PBMC）和小鼠脾細胞增殖的最佳實驗條件，為后期相關研究提供數據，為生物活性藥物的體外篩選提供可靠的篩選體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和動物 Balb/c小鼠，雌性，6周齡，（20±2）g，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心。健康人外周血，第四軍醫大學西京醫院中國人民解放軍西安血站提供。

1.1.2 試劑 CCK-8（Cell Counting Kit-8，日本Donjindo），淋巴細胞分離液（天津TBD），LPS（Sigma），96孔板（Costar），RPMI 1640培養基（Sigma）；青、鏈霉素（華北制藥股份有限公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青）等。

1.1.3 儀器 全自動酶聯免疫分析儀（德國BMG Labtechnologies公司），移液器（美國Gilson公司），CO2細胞培養箱BB16型（德國Heraeus公司），離心機LG15-W型（北京醫用離心機廠），電子天平AB104-N型（梅特勒-托利多儀器有限公司），超凈工作臺（江蘇蘇凈集團有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 人外周血PBMC的分離 以密度梯度離心法分離人外周血PBMC。將淋巴細胞分離液和抗凝血按照1：1的比例先后加入離心管，保持界面清晰。2000 r/min離心20 min。小心吸取血漿和淋巴細胞分離液界面處單個核細胞形成的云霧層。PBS洗滌3遍，臺盼蘭染色計數，細胞活力﹥95%。

1.2.2 小鼠脾細胞的分離 頸椎脫位法處死小鼠，無菌條件下取脾臟，置于盛有RPMI-1640培養液的平皿中。用眼科剪將脾臟剪成小段，置于200目不銹鋼篩網上，用注射器針芯輕壓使細胞通過制成脾細胞懸液，200目尼龍網過濾。臺盼蘭染色，細胞活力﹥95%。

1.2.3 實驗設計 采用正交實驗設計方法（表1）。各因素分別為：A-初始細胞濃度（×106/mL）；B-培養時間（h）；C-LPS濃度（μg/mL），D-加入CCK-8后的顯色時間（h）。其中A因素有4個水平，B、C、D因素各有3個水平。用SPSS 20.0設計L16（41×33）混合正交表（表2～3），觀察指標為刺激指數（SI）。按照表2的試驗安排篩選CCK-8檢測人PBMC增殖試驗最佳條件；按照表3篩選CCK-8檢測小鼠脾淋巴細胞增殖試驗的最佳條件。

1.2.4 淋巴細胞增殖實驗 調節人PBMC或小鼠脾淋巴細胞懸液終濃度為1×106、2.5×106、5×106、1×107/mL；將細胞懸液加至96孔板中，每孔100 μL，每組設6個平行孔；再按照試驗安排加入LPS，20 μL/孔，終濃度分別為0.1、1.0、10 μg/mL，PBS為對照。每孔再加入含10%新生牛血清的RPMI-1640培養液80 μL，終體積為200 μL。37℃，5%CO2，分別培養24、48、72 h。分別在在培養結束前3、4.5、6 h加入CCK-8，20 μL/孔[8]，繼續培養至終點。以空白孔調零（相同培養液200 μL+CCK-8 20 μL），上機檢測吸光度（A450/620），按下列公式計算刺激指數SI。上述實驗重復進行3次，計算。

SI=刺激孔A值/對照孔A值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0進行統計分析，刺激指數用x±s表示。正交設計采用單變量方差分析，驗證實驗采用t檢驗進行顯著性分析。

2 結果

2.1 正交實驗結果

初始細胞濃度、培養時間、LPS濃度、加入CCK-8后孵育的時間4個因素對人PBMC和小鼠脾細胞增殖均有顯著影響（P < 0.01）。由極差進行直觀分析，在人PBMC增殖試驗中，各因素的重要性順序為C>A>B>D。通過比較各水平k值大小，各因素的最優水平為A2、B2、C2、D2，最優組合為：A2B2C2D2，即初始細胞濃度為2.5×106/mL，培養時間為48 h，LPS濃度為1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h是CCK-8檢測人PBMC增殖試驗的最佳條件，即表2中的3號試驗。同理在小鼠脾細胞增殖試驗中各因素對試驗結果影響程度的順序為C>A>B>D，最佳條件組合為A3B2C2D2，即初始細胞濃度為5.0×106/mL，培養時間為48 h，LPS濃度為1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h。但該組合并未包括在正交表中進行試驗，故對該條件組合進行驗證試驗。見表4、5。

2.2 驗證試驗

A3B2C2D2組合滿足試驗要求（P < 0.05）。即初始細胞濃度為5.0×106/mL，培養時間為48 h，LPS濃度為1 μg/mL，加入CCK-8后孵育4.5 h，是CCK-8檢測小鼠脾細胞增殖實驗的最佳條件。見表6。

3 討論

淋巴細胞在絲裂原作用下的可發生增殖和分化，是機體細胞免疫應答能力的一個基本指標，廣泛應用于生物活性因子的活性檢測、高通量藥物篩選等領域。PBMC和小鼠脾淋巴細胞是淋巴細胞增殖實驗中最常用的兩種細胞。檢測淋巴細胞增殖的方法有形態學檢查法、單細胞克隆法，檢測DNA合成含量的放射性核素標記法和檢測細胞代謝活性的比色法等。形態學檢查法存在人工計數的主觀差異，以3H-TdR摻入法為代表的放射性核素標記法比形態學檢查法更客觀、準確、重復性好，但存在放射性污染可能，需要特殊的儀器設備。因此，3H-TdR摻入法雖然敏感，但其應用仍然有限。而四甲基偶氮唑鹽MTT比色法快速簡便，靈敏度高、不需要特殊檢測儀器、無放射性污染、適合大批量檢測，在生物活性因子的檢測[9]、細胞毒性試驗[10]、抗腫瘤藥物篩選[11]以及腫瘤細胞藥敏檢測[12]等方面廣泛應用。但MTT法形成的藍紫色甲臜結晶不溶于水，不能直接測量吸光度，要棄去上清后加二甲基亞砜溶解。由于在吸取上清液時有可能帶走小部分的甲臜，影響測量結果，故重復性不佳。CCK-8法與MTT法具有相似的實驗機制，而且避免了二甲基亞砜對細胞的毒性作用[11]。CCK-8試劑中含有2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽，簡稱為WST-8。它在電子載體1-Methoxy PMS的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為黃色甲臢產物，具高度水溶性，可直接測量，簡化了實驗操作步驟，重復性優于MTT法，實驗結果更準確，在檢測細胞增殖[14-15]、細胞毒性實驗[16]、藥物篩選[17]以及腫瘤藥敏試驗[18]中都可應用。但與MTT相比，CCK-8試劑要昂貴許多[19]。1982年Gratzer制備出抗溴脫氧尿嘧啶核苷BrdU單抗[20]。近年來非放射性標志物的研究發展迅速，標記檢測技術不斷改良提高，應用BrdU標記的敏感性已與3H-TdR相似[21]。目前認為BrdU是最有希望取代同位素的非放射性標志物之一。

本研究分別探討了在人PBMC和小鼠脾淋巴細胞增殖中CCK-8檢測法各自最佳的實驗條件。它們最適的初始細胞濃度分別為2.5×106/mL和5.0×106/mL。最佳培養時間均為48 h。LPS濃度的研究中，1 μg/mL的濃度最適宜，濃度過低不足以刺激淋巴細胞最大程度地增殖，濃度過高（10 μg/mL）則抑制了細胞的增殖（SI<1）。關于加入CCK-8后孵育時間的長短，因血液細胞形成的甲臢很少，資料推薦較長的孵育時間（5～6 h）使顯色充分。但本實驗發現，當孵育時間達到6 h時空白孔吸光度增加，部分細胞數較高的孔吸光度已接近酶標儀讀數的上限，影響實驗的準確性。在上述細胞濃度下，顯色4.5 h已經比較充分，此時空白孔吸收較小，準確度高，故實驗中選擇4.5 h作為最佳孵育時間。

綜上所述，CCK-8檢測法是一種靈敏可靠、簡便快捷的方法。本研究中建立的最佳實驗條件可為生物醫學許多領域，如對具有免疫調節作用的藥物、保健品、中草藥及生物制品的體外篩選和免疫藥理學作用的研究提供可靠的實驗體系。

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（收稿日期：2018-05-07 本文編輯：任 念）