靶向乙肝病毒核心蛋白治療慢性乙型肝炎的研究進展

戴勝蘭 姚俊 許亞平

[摘要] 乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白是HBV核衣殼的組成部分，參與病毒包裝、病毒成熟以及病毒向細胞外釋放等過程，具有cccDNA調節功能并參與誘導機體免疫反應。本文就HBV核心蛋白的結構、功能以及在HBV治療中的研究進展等方面，綜述了近年來靶向HBV核心蛋白治療慢性乙型肝炎的研究現狀，表明核心蛋白質變構調節劑（CpAMs）可作為抗HBV藥物直接靶向HBV核心蛋白而干擾其活性，利用HBV核心蛋白為靶抗原誘導HBV特異性免疫反應具有抗HBV及免疫調節作用，以期為慢性乙型肝炎的治療發展提供參考。

[關鍵詞] 乙型肝炎病毒；慢性乙型肝炎；核心蛋白；共價閉合環狀DNA；免疫反應

[中圖分類號] R512.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）08（a）-0035-04

[Abstract] Hepatitis B virus （HBV） core protein is an integral part of HBV nucleocapsid， which is involved in viral packaging， viral maturation and viral releasing to the outside of cells. Core protein participates in regulation of cccDNA function and the induction of immune responses. This paper summarizes the research progress of targeting hepatitis B virus core protein in the treatment of chronic hepatitis B in recent years， starting from the structure and function of HBV core protein and the progress in the treatment of HBV. All of these indicate that core protein allosteric modulators （CpAMs） can directly interfere with the activity of HBV core protein as anti-HBV drugs， and the use of HBV core protein as a target antigen to induce HBV-specific immune responses has anti-HBV and immunomodulatory effects.These provide a theoretical reference for the development of treatment for chronic hepatitis B.

[Key words] Hepatitis B virus； Chronic hepatitis B； Core protein； Covalently closed circular DNA； Immune response

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的肝臟慢性炎癥性疾病。據統計，全世界約有2.4億慢性HBV感染者，每年約有50萬人死于CHB相關的并發癥（如肝硬化和肝細胞癌等）[1]。當前使用的抗病毒藥物主要為核苷（酸）類似物和干擾素-α，可以有效抑制HBV增殖，減緩乙型肝炎患者的發病進程，但由于不能作用于共價閉合環狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），很難徹底清除病毒[2]。HBV核心蛋白是HBV核衣殼的組成部分，具有重要的生物學特性和功能，在T細胞和B細胞水平上，HBV核心蛋白的抗原性較乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HbeAg）強100倍，幾乎所有HBV感染者都產生HBV核心抗體（hepatitis B virus core antibody，HBcAb），同時存在T細胞免疫應答，機體對核心蛋白的免疫應答在清除HBV過程中具有重要作用[3]。因此HBV核心蛋白已成為抗HBV治療的重要而有前景的干預目標。本文針對HBV核心蛋白的結構、功能以及在HBV治療中的研究進展進行綜述。

1 生物學特性

1.1 HBV核心蛋白的結構特征

HBV核心蛋白由183個氨基酸殘基組成，分子量約21 kD。在HBV復制期間，信使RNA（mRNA）從HBV C基因的開放閱讀框架轉錄，翻譯從C基因的第二個密碼子AUG開始。起始的149個氨基酸殘基形成富含α螺旋的裝配結構域，也被稱為球形的N末端（Nterminal domain，NTD），而末端的34個氨基酸殘基形成富含精氨酸的C端域（Cterminal domain，CTD）[4]。HBV核心蛋白構成同型雙聚體，自行組裝為20面體的核殼。分為兩種類型：90個雙聚體形成三角形數為3（T=3）對稱，31 nm顆粒；120個雙聚體形成三角形數為4（T=4）對稱，35 nm顆粒。乙型肝炎患者體內這兩種顆粒均存在，體積稍大的顆粒占多數[5]。

1.2 HBV核心蛋白與cccDNA的關系

HBV慢性感染的根源是cccDNA的存在，細胞外乙型肝炎病毒DNA是一種松弛環狀的雙鏈DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）分子，在乙肝病毒的復制過程中，病毒DNA進入宿主細胞核，在DNA聚合酶的作用下，形成cccDNA，cccDNA是HBV前基因組RNA復制的原始模板，雖然其含量較少，但對乙肝病毒的復制以及感染狀態的建立具有十分重要的意義，只有清除了細胞核內的cccDNA，才能徹底消除乙肝患者病毒攜帶狀態，是抗病毒治療的目標。然而，多年來用核苷類似物治療可以防止形成新的病毒粒子，但只是偶爾導致病毒的消失[6]。cccDNA與核心蛋白的相互作用知之甚少。從穩定轉染的AD38細胞中分離的cccDNA鑒定核心蛋白，研究發現其與核小體數目的變化相關[7]。染色質免疫沉淀（chromatin immuno-precipitation，ChIP）顯示核心蛋白與CpG島優先關聯[8]。CpG島2上核心蛋白的存在與cccDNA活性增加（即病毒載量）相關，而CpG島2和3中DNA的甲基化與cccDNA活性降低相關[8-9]。有研究推測驅動核心蛋白裝配的小分子[10]降低了游離核心蛋白的濃度，導致cccDNA結合核心蛋白的減少，使得病毒RNA及蛋白質產量減少。E3泛素連接酶NIRF1被認為是消耗cccDNA結合的核心蛋白的另一機制，也導致cccDNA活性抑制[11-12]。這些研究表明，HBV核心蛋白有助于表觀遺傳調控cccDNA，從而有利于延長cccDNA壽命。

干擾素α（IFN-α）被認為可能在表觀遺傳學水平上可以清除HBV感染[13]，但僅在一部分患者中有效。在對免疫調節劑（IFN-α和淋巴毒素β受體抗體）作用機制的研究中，發現有證據表明胞苷脫氨酶APOBEC3A通過與cccDNA結合的核心蛋白直接相互作用被募集到cccDNA，使cccDNA容易被核酸酶降解[13]。這一發現提出了為什么HBV蛋白會招募病毒抑制蛋白的問題。核心蛋白也可以募集NIRF1來調節其穩定性和組蛋白修飾[11-12]。這些研究結果表明核心蛋白具有cccDNA調節功能。

1.3 HBV核心蛋白與機體免疫反應

HBV核心蛋白參與IFN-α介導的cccDNA的破壞[13]。并且核心蛋白與干擾素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISG）之間的相互作用也參與其中。在細胞系研究中發現HBV核心蛋白抑制雙鏈DNA介導的IFN應答。這種抑制的必要條件是核心蛋白的核位置可抑制ISG的轉錄[14]。核心蛋白也與腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（tumour necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）相互作用，TRAIL與HBV感染的肝細胞死亡有關。核心蛋白的過度表達可減少TRAIL誘導的人肝癌細胞凋亡，這與死亡受體5的表達減少有關[15]。

核心蛋白不僅作為病毒結構蛋白，還涉及HBV復制中的許多重要功能，參與病毒包裝、病毒成熟以及病毒向細胞外釋放等過程。核心蛋白也是B細胞、T輔助細胞和細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）免疫介導的病毒清除的目標[16]。氮末端（N-terminal domain，NTD）NTD和碳末端（C-terminal domain，CTD）都可表達CTL和T細胞的表位，而B細胞表位主要在NTD上發現。這些表位的突變已顯示可影響機體免疫反應[17-18]。在人類病例中，突變在CTL表位CTD的磷酸化位點與高級別肝纖維化相關[19]。核心蛋白通過與機體免疫因子相互作用，可調節病毒活性和肝細胞損傷，對核心蛋白的免疫應答在病毒清除中可能具有重要意義。

2 靶向乙肝病毒核心蛋白在慢性乙型肝炎治療中的應用

2.1 直接靶向HBV核心蛋白的抗病毒藥物

核心蛋白具有組裝惰性衣殼之外的活性，小分子可以通過作用于具體的核心蛋白構象而差異地干擾每一種活性，這類小分子物質被稱為核心蛋白質變構調節劑（core protein allosteric modulators，CpAMs）。CpAMs的作用機制可分為3類：①形成異常裝配的核衣殼（而不是二十面體晶格）；②形成不能包裹前基因組RNA（pregenomicRNA，pgRNA）的“正常形狀”核衣殼，即空殼體；③干擾形成新的cccDNA。

雜芳基二氫嘧啶（HAPs）是被研究較多的一類通過第一種機制起作用的CpAMs。體外研究表明，HAPs在廣泛的濃度范圍內促進核心蛋白裝配成無功能衣殼聚合物[10，20]。不同的HAPs導致不同形式的衣殼聚合物[10]。除了影響殼裝配外，HAP在顯示病毒抑制活性時所需濃度遠低于影響衣殼組裝所需要的濃度，這表明HAPs抗病毒活性的動力學效應與異常衣殼結構無關[21]，且在小鼠體內研究中未發現嚴重毒性。

苯丙烯酰胺（PPAs）通過第二種機制起作用（即形成不能包裝pgRNA的空殼體）的另一類CpAMs。細胞培養中發現這些化合物抑制HBV感染并可加速衣殼裝配[22]。PPAs存在時，衣殼組裝正常，仍然形成具有正常形態的二十面體核衣殼[23]。然而這些“正常的核衣殼”沒有包裹pgRNA，導致積累的空衣殼影響后續下游的病毒學復制。這些研究表明，PPAs的作用機制處于病毒衣殼和RNA包裝水平[24]。

HAP12是高濃度靶向裝配一類CpAMs，可以通過抑制cccDNA復制靶向cccDNA形成。研究表明，HAP12可弱結合核心蛋白變構影響cccDNA[25]。作用于核心蛋白的裝配上游的這種變構調節劑是否具有降低cccDNA活性和控制慢性感染的潛力尚需進一步研究。

2.2 基于HBV核心蛋白的治療性疫苗

Maini等[26]研究發現在能夠抑制HBV復制及阻遏肝臟損傷的CHB患者體內存在較高的HBc特異性CTL水平，研究證實了CHB患者體內存在保護性的肝源性HBc特異性CTL和致病性抗原非特異性免疫。以上研究為應用以核心蛋白為基礎的免疫干預治療CHB提供了理論基礎。Heathcote等[27]在20世紀90年代就以核心蛋白的表位為基礎治療CHB患者。HBV轉基因小鼠含有HBV基因組和所有HBV相關抗原，可用來評估疫苗的效果。Akbar等[28]在HBV轉基因小鼠體內評估以核心蛋白為基礎的細胞疫苗對肝內免疫力的影響，研究發現，以核心蛋白為基礎的疫苗免疫后，血清中HBsAg轉陰并產生抗-HBs。此外，肝臟內可檢測到HBs和HBc特異性CTL。另外，在HBV感染的鴨和土撥鼠模型中已經顯示了HBV核心蛋白作為試驗性治療性疫苗的作用[29-30]。利用HBV核心蛋白為靶抗原誘導HBV特異性免疫反應在治療慢性HBV感染方面具有重要意義。研究發現將HBV核心蛋白強制泛素化后，核心蛋白降解速度加快，誘導的免疫反應增強，強制泛素化的核心蛋白體外可誘導DC成熟、刺激T淋巴細胞增殖及產生HBV特異性CTL反應[31-33]，在小鼠體內可誘導HBc特異性CTL反應，并可抑制HBV復制[34-35]。但目前可供人類應用的HBV核心蛋白疫苗仍然需進一步研究開發。

3 結語

近年來，對于HBV核心蛋白的結構及功能已經有了較深入的認識，核心蛋白作為病毒結構蛋白，參與病毒包裝、病毒成熟以及病毒向細胞外釋放等過程，并與機體免疫反應有關。靶向核心蛋白的治療包括CpAMs和治療性疫苗有望為抗HBV提供了新的治療策略，但目前仍然缺乏臨床研究來評價，有待進一步的研究證實。

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