乙肝病毒檢測在臨床應用的研究進展

陳善昌

摘要：固相放射免疫法、反向被動血凝改良一步法、酶聯免疫吸附法、膠體金免疫層析、實驗微粒子酶免疫分析、化學發光免疫法、時間分辨熒光免疫法、核酸探針法、多聚酶鏈式反應、基因芯片技術方法對檢測乙型肝炎有一定的優越性，可為臨床診斷、用藥療效等提供準確可靠的實驗依據。筆者對相關研究進展進行綜述。

關鍵詞：乙型肝炎病毒；酶聯免疫吸附法；核酸探針法

中圖分類號：R446.112；R512.62 文獻標志碼：A 文章編號：1008—2409（2016）04—0166—05

1965年Blumberg發現“澳大利亞抗原”，隨后確定為乙肝病毒表面抗原（HBsAg），1970年英國的Dane等在電鏡下鑒定了直徑為42 nln完整的乙肝病毒顆粒，又稱為Dane顆粒，1986年被列入嗜肝DNA病毒科，并闡明了顆粒的HBsAg、HBcAg、HBeAg等成分。乙肝病毒檢測技術經歷了20世紀60年代的放射免疫技術（RIA）、20世紀70年代的酶標技術（ELESA）、20世紀80年代化學發光技術（CLIA）、20世紀90年代的時間分辨技術（TRFIA）及現在正在研究的生物芯片技術。近幾年來，隨著對乙型肝炎發病機制、HBV感染與復制等研究的深入，發現HBV感染呈世界性分布，許多慢性感染者演變成慢性活動性肝炎、肝硬化、肝癌，嚴重威脅人類健康。現就乙肝病毒結構、檢測及其在臨床上的應用綜述如下。

1乙肝病毒結構

乙肝病毒結構是一個具有外殼和核心兩部分完整的乙肝病毒顆粒，直徑約42nm，HBV基因組有一個約3 200 bp小環行DNA結構，雙鏈長度不對稱。外殼厚7～8 nm，由脂質雙層和蛋白質組成的囊膜。核心部分——含DNA和DNA聚合酶（病毒復制所需的酶），DNA分子含有約3 200個核苷酸。它包括1個長度固定的負鏈和另一長度不定的正鏈。正鏈開放讀碼區，不能編碼病毒蛋白。而負鏈能編碼全部已知的乙肝病毒蛋白質，有4個開放區，分別稱為S、C、P及X，這四個開放區的開放讀碼框架為：①S基因區，由S基因和前S基因組成。S基因（核苷酸155～833）能編碼主要表面蛋白。前S基因能編碼Pre S1和Pre S2蛋白。②C基因區，由前C基因和C基因組成。分別編碼HBeAg及HBcAg。③P基因區，最長，約占基因組75%以上，編碼病毒體DNA多聚酶。并具有逆轉錄酶活性。④X基因區，可能編碼有154個氨基酸的堿性多肽，長鏈的裂口位于此區編碼HBxAg，并具有激活HBcAg基因的作用。

2乙肝病毒檢測方法

2.1固相放射免疫法（SPRIA）

該法是檢測乙肝表面抗原的經典方法之一。是利用放射性同位素標記已知抗原或抗體，使其與待測相應抗體或抗原結合，洗去未結合部分，最好用γ計數器測定放射性強度，從而推算抗原或抗體含量。優點：準確性和靈敏度都較高，檢測生物活性物質可達pg水平，比ELISA靈敏度高20倍。缺點：所需設備復雜，操作技術要求較高，鄉鎮醫療單位難以推廣。

2.2反向被動血凝改良一步法

反向被動血凝法（RPHA）檢測乙型肝炎表面抗原（HBsAg）具有靈敏、快速、簡便、可對表面抗原作相對定量等優點。改良一步法避免了非特異性凝集反應，操作過程及反應時間比反向被動血凝法快1倍以上。節省人力和試劑，適合于常規檢查和大規模體檢的確證試驗。在20世紀70年代至80年代，該方法檢測HBsAg在我國占據了重要地位。

2.3酶聯免疫吸附法（ELISA）

我國在20世紀70年代開始引入該法檢測乙型肝炎標志物，其發展迅速，很快覆蓋了醫學檢驗的諸多領域。優點：靈敏度高、特異性強、重復好、簡便、經濟，對環境和人體無危害，試劑有效期長，是檢測乙型肝炎病毒血清標志物首選方法。缺點：抗原抗體比例不合適可引起鉤狀效應；試劑不均一性、血清不稀釋產生的非特異性反應及檢驗人員熟練程度均可影響其準確性，影響檢測結果因素較多。

2.4膠體金免疫層析實驗（GICA）

該法是以膠體金作為標志物，利用層析作用檢測抗原或抗體。與ELISA比優點：可測末梢全血或血清，用量少、簡便、快速、不需儀器設備，尤其為無償獻血者現場采血前的檢測，提供了便利條件。缺點：靈敏度較低于ELISA，弱陽性標本容易漏檢。有學者采集40份標準血清分別使用以下3種方法進行檢測，電化學發光法檢出的陽性率為65%，靈敏度100%；進口試劑盒ELISA法的陽性率為65%，靈敏度100%；國產試劑盒ELISA法的陽性率為50%，靈敏度76.9%；膠體金免疫層析法的陽性率為22.5%，靈敏度僅為34.6%。

2.5微粒子酶免疫分析（MEIA）

此法檢測表面抗原是目前世界上檢測乙型肝炎病毒標記物的金標準。對HBsAg檢測靈敏度可達0.17～0.20 ng/ml，優點是：全自動檢測，人為造成誤差因素少，抗干擾能力強，重復性好，可單份檢測，對病情可做動態檢測。缺點：儀器和試劑成本較高，基層醫院難于普及。

2.6化學發光免疫法（ECLIA）

隨著電化學發光免疫分析技術的發展，化學發光應用到臨床免疫學檢驗，該方法學使用固相載體為順磁性微粒，擴大了反應面積，同時由于標志物的循環利用，延長發光時間，增加強度，大大提高了檢測靈敏度，能檢出低濃度至0.13 ng/ml的HBsAg，對于控制傳染源、流行病學及監測HBV復制狀態和評價抗病毒治療效果有重要作用。

2.7時間分辨熒光免疫法（TRFIA）

該法是我國近年來較多臨床實驗室檢測乙肝兩對半最有潛力的一種標記免疫分析方法。其熒光壽命延長了，降低了本底因素影響，特異性和穩定性都有顯著提高，現已廣泛應用于各種指標的檢測。優點：無放射物質危害，不受自然熒光干擾，避免了人為因素引起的加樣誤差和鉤狀效應產生，靈敏度和特異性強、標準曲線范圍寬、無放射性污染、檢測重復性好，能動態觀察療效和監測病情及HBsAb的定量測定能夠對乙肝的預防起到監督作用。缺點：檢測所需時間過長，無法快速檢測，且費用較高，不利于基層以下醫院開展。TRFLA法與ELISA法比較：TRFLA法能檢測低濃度HBsAg攜帶者，能在急性乙肝早期檢出HBsAg，而ELISA法實驗時間雖然較短，但如果標本中HBsAg濃度過高會因鉤狀效應導致漏檢。

2.8核酸探針法

核酸探針技術是屬于生物學技術領域的一個先進檢測手段，我國20世紀80年代末90年代初發展起來的分子微生物學技術。特點：敏感性和特異性較強。大量研究顯示，核酸探針法檢出HBV-DNA的陽性率顯著高于ELISA法檢出的HB eA g的陽性率。

2.9多聚酶鏈式反應

多聚酶鏈式反應此法由Saiki首次提出，我國在20世紀90年代初廣泛應用，是一種模擬天然DNA復制過程，在體外擴增特異性DNA（或RNA）片段的新技術。可分為定性和定量，其敏感性及特異性比核酸探針法更強。錢宇等研究報道，免疫蒙光定量PCR方法直接測定病毒量，明確反映病毒感染程度，其測定值與ALT呈一定程度正相關，與肝炎輕、中、重程度及肝纖維化程度成反比。

2.10基因芯片技術

又稱DNA芯片、生物芯片，是目前研究領域的新檢測技術。具有高通量、快速等特點，在病毒基因表達譜的研究、病毒流行學的研究等方面得到廣泛的應用。

3乙肝病毒檢測在臨床的應用價值

乙型肝炎嚴重危害人類健康，我國是乙型肝炎的高發區，據衛生部統計，目前，乙型肝炎病毒（hepatitis vi-rus B，HBV）攜帶者在我國已有1.3億人，約占總人口的1/10。約25%的感染者發展成為慢性乙型肝炎（簡稱乙肝）。其中慢性乙型肝炎是發展成肝硬化和肝細胞癌的主要危險因素，嚴重危害我國人民的健康水平和生活質量。乙型肝炎血清學標志物為檢測乙型病毒感染的最主要病原標志和直接證據之一。乙肝兩對半檢查項目包括：乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝表面抗體（HBsAb）、乙肝e抗原（HBeAg）、乙肝e抗體（HBeAb）及乙肝核心抗體（HBcAb）。在病毒感染緩解和愈合的不同時期，可有不同的模式存在。

3.1乙肝兩對半各種模式的臨床意義

乙肝兩對半各種模式的臨床意義見表1。

3.2乙肝兩對半各項的臨床意義

3.2.1乙肝表面抗原 乙肝表面抗原是乙肝病毒的外殼蛋白，本身不具有傳染性，但它的出現常伴隨乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的標志。臨床意義：是乙型肝炎病毒感染的早期診斷指標，陽性為已經感染病毒的標志，并不反映病毒復制和傳染性的強弱，陰性也不能排除乙型肝炎病毒感染。

3.2.2乙肝表面抗體 當人體受到乙型肝炎病毒侵入后，刺激人的免疫系統產生免疫反應，人體免疫系統中的B淋巴細胞分泌出一種特異的免疫球蛋白G。它可以和表面抗原特異地結合，在體內與人體的其他免疫功能共同作用下，可清除病毒，保護人體不再受乙肝病毒感染，故稱表面抗體為保護性抗體。臨床意義：為中和性抗體標志，是否康復或是否有抵抗力的主要標志。陽性見于既往感染已好轉或接種乙肝疫苗，對乙型肝炎病毒感染具有保護作用。

3.2.3乙肝e抗原 乙肝e抗原是乙型肝炎病毒的核心，是核心抗原裂解后的產物。其臨床意義為：陽性為病毒復制標志，病毒復制活躍，傳染性強，持續陽性3個月以上則有慢性化傾向。HBeAg陽性與乙肝病毒的復制程度呈正相關，HBeAg是HBV高度傳染性的指標。黃建煒等研究，HBeAg陽性標志著HBV的高水平復制，但HBeAg陽性者僅占HBV攜帶者總數的21.7%，與HBVDNA陽性符合率39.5%，低于HBsAg（79.8%）。

3.2.4乙型肝炎e抗體 乙型肝炎e抗體是由e抗原刺激人體免疫系統產生出來的特異性抗體，這種特異性e抗體能夠和e抗原結合。臨床意義：陽性說明病毒復制減少，或病毒復制停止標志，傳染性較弱但，e抗體陽性不是保護性抗體，患者沒有抗乙肝病毒的免疫力。

3.2.5乙肝核心抗體 血清中核心抗原刺激身體的免疫系統產生出特性抗體，即核心抗體，通過檢測乙肝核心抗體可以了解人體是否有過乙肝病毒的感染。臨床意義：乙肝核心抗體是一項病毒感染的標志。陽性為曾感染或感染期出現的標志。且乙肝病毒復制活躍、是傳染性強的指標之一。對于輔助兩對半檢查有一定意義。

4乙肝病毒DNA及基因分型檢測在臨床上的應用價值

乙肝病毒DNA定量檢測在臨床應用越來越廣，HBV DNA值更能準確、靈敏地反映HBV病毒復制的程度。體內有無HBV復制最好通過乙肝五項指標及HBV DNA的檢測結果提示來判斷患者的免疫恢復、病情分期或排除HBV感染的存在才能為患者的病情提供較為準確的判斷，較好地為臨床合理治療用藥提供依據。乙肝病毒DNA定量檢測指標降低是乙肝轉陰的前奏，也是康復最為關鍵的一步，只有體內的乙肝病毒DNA定量指標降低，乙肝病毒的復制繁殖才會停止，乙肝的徹底治愈才有希望，因此，熒光定量PCR檢測乙肝病毒DNA，為臨床醫生對乙型肝炎傳染性的判斷、用藥療效的監測及預后的判斷提供了診斷依據。乙肝病毒定量檢測，對治療前進行檢測可以指導選擇對癥藥品，避免盲目用藥；對治療后定量PCR檢測可直接正確地測定體內乙肝病毒數目，有助于用藥療效的判定及指導用藥。王永忠等對146份急慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者血清中HBV DNA基因分型研究結果，肝硬化和肝癌患者主要為C基因型感染，顯著高于慢性乙型肝炎患者，（X²=7.65，P=0.01）。姚光弼等的研究報道，ALT反跳合并有HBVDNA的反跳患者有38.7%，而HBV DNA反跳時合并有ALT的反跳的患者只有18.5%，HBV DNA的反跳與ALT的反跳似乎沒有必然的聯系。

綜上所述，酶聯免疫吸附法（ELISA）靈敏度高、特異性強，成本較低，適合于血站、綜合醫院等標本量大的醫療機構實驗室開展；膠體金免疫層析法適合于快速檢測時使用；微粒子酶免疫分析（MEIA）、化學發光免疫法（ECLIA）和時間分辨熒光免疫法（TRFIA）因成本較高，適合于經濟條件較好的醫療機構實驗室開展。乙型肝炎標志物檢測方法各有優越性，檢驗的目的是為臨床服務，因此，各臨床實驗室應該根據自己條件及臨床醫生的要求來選擇檢測方法，為臨床診斷、用藥療效等提供準確可靠的實驗依據。