線栓法制作大鼠局灶性缺血性腦損傷模型方法研究

王新鳳 張滕飛 程謙謙 李妍怡

【摘 要】 目的：提供制備大鼠局灶性缺血性腦損傷模型的方法。方法：SD雄性大鼠60只，體重260～280g，隨機分為空白對照組，假手術組，缺血性腦損傷再灌注組。缺血再灌注的時間點為1d、3d、7d、14d，每組各10只。頸部正中切口，采用從頸外動脈插入線栓繞過頸總動脈分叉進入頸內動脈的方法。用0.235mm魚線造成大鼠中動脈血供阻斷（MCAO）2h。采用大體和組織學的觀察方法，研究腦組織梗死灶及血管的變化。結果：空白組和假手術組未見梗死灶，缺血性腦損傷再灌注組有梗死灶形成。結論：該線栓法制作缺血性腦損傷模型方法穩定可靠，成功率高，死亡率低。

【關鍵詞】 線栓法；缺血性腦損傷；大鼠模型

【中圖分類號】R-332 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2018）05-0033-04

Abstract：Objective To provide a model for the preparation of focal cerebral ischemic brain injuire in rats. Methods 60 SD male rats， weight 260～280g， were randomly divided into blank control group， control group， the cerebral ischemic reperfusion injury group， Ischemia reperfusion time point for 1d， 3d， 7d， 14d. Each group of 10.Neck midline incision， use the insert line from the external carotid artery bolt to bypass the method of common carotid artery into the internal carotid artery bifurcation. With a 0.235mm line caused artery of rats in the block （MCAO） 2h. The gross and histological observation method， research on brain infarcts and the change of the blood vessels. Results Blank group and control group did not see infarcts，cerebral ischemic reperfusion injury group has formed infarcts. Conclusion Line bolt legal system for ischemic brain injury model method is stable and reliable， high success rate， low mortality rate.

Keywords：Line Plug Method；Lschemic Brain Injury；Rat Model

急性腦血管病又稱腦卒中，其發病率逐年上升，已成為第一大致殘病因和第二大致死病因。流行病學調查結果顯示[1]，我國每年新發腦卒中病例約有200萬，年腦卒中發病率約為（116～219） /10萬人口，年腦卒中死亡率約達到發病率的一半：（ 58～142 ） /10萬人口。腦卒中又可分為缺血性腦卒中（ischemic Stroke， IS）和出血性腦卒中（Hemorrhagic Stroke ）[2]，其中缺血性腦卒中占全部腦卒中發病率的80%左右，并且其發病率隨年齡的增長而增高。因此，了解缺血性腦卒中的發生發展和防止措施具有重要意義。本實驗使用線栓法阻斷大鼠大腦中動脈（Middle Celebral Artery，MCA）制作缺血性腦損傷的方法，制作成熟的大鼠缺血性腦損傷模型是該研究的基礎。然而，該模型的方法已有多種，在前人工作的基礎上進行改良和反復驗證，結合在其他實驗室的技術，現將本實驗的造模過程和結果報道如下。

1 儀器與材料

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠，60只，體重260～280g。由甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（甘）2015-0002。飼養于甘肅中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室，室溫（23±2）℃，濕度45%～55%，自由飲水處理原則。

1.2 材料 水合氯醛（天津市光復精細化工研究所）；磷酸鹽標準緩沖液（批號：1114A029，北京索萊寶科技有限公司）；魚線（愛魚者德國原絲魚線）；微型動脈夾（美萊醫療器械）；24孔板（海門市春博生物實驗器械廠）。

2 方法

2.1 造模與分組 將直徑0.235mm的魚線用鋒利的手術刀片裁剪為長約3～4cm/段，用酒精燈將魚線一端輕微燒一下（目的把魚線頭端燒圓滑，切記把魚線頭端燒成釘子帽狀。）之后用黑色Marker筆，用刻度尺比量，從魚線頭端開始計算，距離18～20mm處對線栓做標記。把制作好入選的線栓放入實驗盒子內備用。按照3～5mL/kg體重的量腹腔注射10%水合氯醛麻醉動物，待大鼠麻醉充分將大鼠平躺與手術操作臺上。術前常規消毒，在大鼠頸部正中處，從下頜下1.5～2cm開始，做一大約長為3cm左右的切口，之后小心剝離出大鼠的右側頸總動脈，頸外動脈，頸內動脈三條動脈分叉處，將頸外動脈離心處永久性結扎，用微型血管夾夾住頸總動脈和頸內動脈，在頸外動脈向心處打一活結，用于固定線栓，在頸外動脈活結和死結之間剪一小口，剪破血管時注意血管剪與血管之間呈45°角，剪口寬度不超過總血管的1/2。將準備好的線栓從切口處插入頸外動脈向心端，到達頸總動脈與頸內、外血管分叉處，繞過分叉處進入頸內動脈，此時剪斷頸外動脈死結的向心處，取開頸內動脈的血管夾，調整線栓角度，順勢經過頸內動脈進入大腦中動脈。在從頸總動脈分叉處記起，線栓大約進入18～20mm處時，線栓會受到輕微阻力，停止插線栓。扎緊在頸外動脈向心處活結。2h后拔出線栓至頸總動脈分叉處。待大鼠清醒后行模型評分，將制作成功的模型按照隨機數字表分組，根據 1d、3d、7d、14d分為四組，每組各10只。其中未活到預計天數者，隨時補充，保證每組10只。假手術組在下頜處打開切口，之后小心剝離出大鼠的右側頸總動脈，頸外動脈，頸內動脈三條動脈分叉處，不做任何處理，縫合切口。

2.2 觀察指標 對各實驗組大鼠采用Bederson[3]等0～5分評分標準進行神經功能評分。標準如下：0分-神經功能完全正常，活動自如；1分-對側（左前肢）肌力下降，呈內收屈曲狀；2分-對側（左側）自主旋轉或劃圈，平地時；3分-對側（左側）傾倒，平地時；4分-昏睡或者昏迷的意識障礙；5分-大鼠的死亡。其中1-3分為成功模型。

2.3 標本采集 取成功MCAO模型根據1d、3d、7d、14d行缺血再灌。采用10%水合氯醛按照3～4mL/kg的劑量對大鼠進行腹腔注射麻醉。待麻醉成功后，使用實驗動物電動剃須刀將麻醉成功的大鼠胸腹部的毛發剪去，將大鼠仰臥于手術臺上，四肢固定，常規消毒鋪巾，按照無菌原則手術操作；沿前正中線剪開皮膚、鈍性分離皮下組織，組織剪從胸骨柄正中剪開，使用止血鉗夾閉出血動脈止血，充分暴露大鼠心臟、主動脈，從心尖處插入動靜脈留置針（針頭內包含針芯）至主動脈根部，拔出針芯，連接輸液管，剪開右心耳，立即用含有肝素（10μ/mL）的生理鹽水行心臟灌注，待大鼠肝臟組織顏色變淡，且從右心耳出口流出的灌注液由紅色逐漸變淡并呈完全清亮為止。將大鼠俯臥于手術臺上，固定大鼠頭部、四肢，常規消毒鋪巾，按照無菌原則手術操作，沿頭部背側中線剪開皮膚，分離皮下組織，剝離骨膜，止血鉗咬除大鼠頂部顱骨，小心分離取出大鼠腦組織，取出置于-80℃冰箱保存留用。

2.4 MCAO再灌注模型HE染色 石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木素染色4min，流水沖洗，1%的鹽酸酒精溶液分化5s，流水沖洗，伊紅染色2min，水洗3次，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

2.5 MCAO再灌注模型TTC染色 ①TC染液的配置：用0.1mol/LpH7.5的磷酸緩沖液配制成0.5%濃度的TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑），并調溶液的pH到6.8～7.2。②切片：將在-20℃的冰箱中保存的腦子取出，一般切成5～6片， 每隔2mm 切一片。第1刀在腦前極與視交叉連線中點處；第2刀在視交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間，總共切6片。③將切片置于TTC 中， 37℃的30min，4%多聚甲醛固定12h。之后將數據輸入Image Pro Plus5.0軟件進行處理，確定缺血部位的梗死面積。

2.6 統計學方法 采用SPSS 18.0軟件統計分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，樣本組間均數差異的比較選用one-way ANOVE方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠神經功能評分結果 采用Bederson等0-5分評分標準進行神經功能評分。實驗點選取，2h、1d、3d、7d、14d。實驗對象：每只成功模型大鼠。神經功能評分隨著腦缺血再灌注的延長而慢慢恢復。結果是跟空白組比較，腦缺血再灌2h神經功能評分3～4分（P<0.01）；1d神經功能評分3分（P<0.01）；3d神經功能評分2～3分（P﹤0.01）；7d神經功能評分1～2分（P<0.05）；14d神經功能評分0～1分（P>0.05）。結果如圖1所示。

3.2 MCAO模型再灌HE染色結果 空白對照組和假手術組HE染色切片呈紅色，缺血損傷再灌注組正常組織HE染色呈紅色，梗死灶呈白色，兩者界限明顯。正常組的細胞排列整齊，腦白質組織結構正常，細胞核飽滿無固縮，假手術組與之相比較無明顯變化。M1組染色逐漸變淺，腦白質結構變得疏松，細胞核固縮并且細胞排列紊亂，隨時間增加表現明顯。M7組后染色相對清晰，腦白質結構逐漸正常，細胞核固縮現象明顯減輕，細胞排列逐漸整齊。M14基本恢復正常。如圖2所示。

3.3 MCAO模型再灌TTC染色結果 成功的腦缺血再灌注模型因大腦中動脈阻塞缺血而導致腦組織壞死，壞死的腦組織不能被TTC染色而呈現蒼白色，未缺血的部分被TTC染成紅褐色。如圖3所示。與正常組相比較，模型14d組差異無統計學意義（P﹥0.05），隨著時間增加，梗死面積逐漸增大，模型1d，3d差異有統計學意義（P﹤0.01），7d梗死面積差異有統計學意義（P﹤0.05）。7d后梗死面積逐漸縮小。見表1。

4 討論

缺血性腦損傷發病率的逐年上升，引起了國內外學者對其發病機制和治療方法的高度重視，作為該病研究的基礎，用線栓法制作成功的缺血性腦損傷模型具重要作用。應用線栓法阻斷大鼠大腦中動脈造成缺血性腦損傷模型方法有多種，其后手術方法也有多種改進，目的是為了手術創傷更小，操作更簡單，成功率高，死亡率低。之前最常用的造模方法是從頸總動脈剪一“V”字行切口[4]，從頸總動脈插入進入大鼠大腦中動脈。該方法雖然不用分離頸內動脈，在血管機械刺激方面較小[5]，但是該方法很難從頸總動脈進入大鼠大腦中動脈，線栓大約進入10mm處就不能進入，期間調整角度，反復插入，反而加重損傷，增加死亡率。

實驗結果顯示：從頸外動脈插入繞過分叉路口進入頸內動脈時更易進入大鼠大腦中動脈，解決了很多學者用之前的方法很難進入大鼠大腦中動脈而導致模型評分低和死亡率高的缺點。并且造模時間更短，效率更高，成功率高，完成一只動物造模僅用10～15min，死亡率低至10%以下。本實驗同時表明，造模2h后拔出魚線，隨時間增加梗死面積逐漸增大，但到7d后，梗死面積逐漸減小，到14d時神經功能得到改善，故而說明，在發生缺血性腦損傷的同時，內源性的代償機制也被觸發，此過程可見血管生成。本實驗結果為后續缺血性腦損傷機制和治療方面的研究提供基礎和思路。

參考文獻

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[3]Bederson JB， Pitts LH， Tsuji M， et al.Rat middle cerebral artery occlusion： evaluation of the model and development of a neurologic evaluation[J]. Stroke，1986，17（3）： 472- 476.

[4]關云謙，孫明，徐超.大鼠頸內動脈線栓法制備局灶性腦缺血模型及影響因素[J].國外醫學腦血管疾病分冊，2001（9）：151- 153.

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（收稿日期：2018-01-18 編輯：程鵬飛）