眼點擬微綠球藻養殖過程中細菌污染的治理方法

耿金峰，趙鄢鵬，馮 倩，蔡忠貞，王慧嶺，張晉陽，王 冰，劉敏勝，白雪梅

(新奧科技發展有限公司，煤基低碳能源國家重點實驗室，河北廊坊 065001)

微藻是一類種類繁多、生長速度快、具有極大應用價值的生物資源。微藻是海洋生物資源的重要來源，是生態系統中最主要的初級生產者。藻類是地球上通過光合作用合成物質量最多的生物，它合成的物質量約占全部光合作用合成生物量的1/3。許多海洋微藻富含對人體有重要生理作用與保健功能的長鏈多不飽和脂肪酸，微藻及其代謝產物可用于天然食品、營養品、保健食品、生物餌料、生物肥料、可持續生物能源生產等方面，具有重要的經濟價值和社會價值[1-5]。其中眼點擬微綠球藻體內含有大量的二十碳五烯酸(EPA)，是天然的EPA來源[6-7]，其藻粉添加到畜禽飼料和畜牧飼料中，將提高雞蛋中EPA含量和動物肉質中EPA含量，提升產品營養價值和附加值，可為養殖戶增加收入；而且眼點擬微綠球藻已經進入中國飼料原料目錄中，具有巨大的應用潛力。

世界范圍內很多科研機構和高校都在對微藻進行著系統的、深入的、高水平的研究[8]。在研究條件穩定的情況下，其微藻的產量較高，如Zhang等[9]在日本的北方地區，夏季利用1.5 cm板式反應器培養集胞藻，在試驗控溫的情況下占地面積產量可達39.0 g/(m2·d)；Torzillo等[10]研究發現養殖水平可達到14.8 g/(m2·d)；Moheimani等[11]報道的養殖水平為16.0～33.5 g/(m2·d)。而微藻生產企業實際的戶外微藻養殖中產量較低，一般在5～10 g/(m2·d)。究其原因，除了自然的晴天、陰天、多云、高溫、低溫等多變的條件外，還有一個重要的影響因素就是敵害生物污染問題。微藻養殖過程若遇到嚴重的敵害生物污染發生，將會導致養殖顆粒無收[12]。因此，微藻養殖過程中的敵害生物污染嚴重制約著微藻的規模化過程，限制生物資源的開發，限制眼點擬微綠球藻在飼料產業中應用。目前科學家們對污染的關注度也是越來越高。微藻養殖過程的污染可分為原生動物污染和細菌污染，其中對原生動物污染目前研究成果顯著，如吳松[13]使用表面活性劑、漂白粉對原生動物的滅殺；叢立晶等[14]利用酸化法、堿化法等對藻液中的纖毛蟲、游捕蟲進行治理；規模化較常用的方法還有碳酸銨鹽法等[12,15]。而細菌和微藻是一個共生體[16-19]，有些細菌對微藻有促進作用，有些細菌對微藻有抑制作用[20-22]，甚至有些細菌具有溶藻的特性[23-25]，可以導致藻細胞較快速死亡，嚴重的將導致養殖失敗。目前針對細菌污染的有效方法是抗生素治理，如劉曉娟等[26]研究多種抗生素去除藻液中細菌，從而獲得無菌藻株；宋程飛等[27]利用抗生素建立杜氏鹽藻的無菌培養體系。但抗生素對環境存在污染，主要殘留在水體中[28]，將影響人類健康。抗生素殘留去除的研究主要集中在畜禽類廢水中，研究的去除方法有活性炭吸附、光降解、紫外法、臭氧法等[28-31]，而藻液中關于抗生素殘留的去除研究鮮見報道，而且部分抗生素對藻類的毒性很大[28]。因此，筆者以可應用于飼料領域的眼點擬微綠球藻為研究對象，針對該藻株戶外養殖過程的細菌污染進行研究，首先篩選對藻細胞有致死作用細菌的有效抗生素，在此基礎上針對抗生素開展深入的去除方法研究，獲得的去除方法既要保證抗生素的有效去除同時又要保證不能對微藻生長帶來顯著的抑制作用。這些研究結果將會為微藻的細菌污染治理提供基礎數據積累與支持，為眼點擬微綠球藻的戶外穩定養殖提供一種抗細菌污染的技術儲備。

1 材料與方法

1.1材料試驗所用抗生素均購自Sigma公司，配制成1 g/L 母液，根據需要進行稀釋(母液經0.22 μm濾膜除菌，稀釋全過程無菌操作)。金黃色葡萄球菌，購自中國微生物研究所，編號1.2465。試驗過程其他試劑均為常規分析純試劑。

1.2儀器臭氧機，北京山美水美環保高科技有限公司CF-YG10型。分光光度計，日本島津UV-2550型。

1.3藻種與培養試驗所用眼點擬微綠球藻(Nannochloropsisoculata)，由ENN生物質能源技術中心藻種質庫提供。所有試驗培養基均采用f/2海水培養基[16]，鹽度為(3.3±0.1)%。試驗采用批次培養的方式進行。

細菌污染的藻液，簡稱污染藻液(下同)：來自眼點擬微綠球藻戶外培養過程得到，細菌數量在106/mL數量級上。其中導致藻細胞死亡的細菌已經得到分離，并得到分子鑒定。

1.4試驗方法

1.4.1接種密度。各試驗組藻細胞接種密度在0.8～1.0 g/L，主要以各試驗組相同體積下具有相同的生物質量為原則。

1.4.2試驗用反應器規格。玻璃板式反應器，10 cm(長)×5 cm(寬)×60 cm(高)，其中反應器寬度即反應器光程。玻璃柱式反應器，內徑5 cm、高度80 cm玻璃柱式(管式)反應器，一側封口、一側開口。

1.4.3抗生素選擇試驗。

1.4.3.1藻種對抗生素耐受性試驗。從5大類抗生素(β-內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類、大環內酯類和氯霉素類)中選擇常見的抗生素對藻細胞進行其耐受性試驗，依次分別選取青霉素、慶大霉素、四環素、紅霉素和氯霉素，其中各抗生素的使用量均分別為50、100、200 mg/L這3個濃度梯度。

試驗方法：各試驗組使用100 mL三角瓶，裝有30 mL無菌培養的藻液，根據表1依次加入對應量的抗生素，放置在搖床中、2 000 lx光強下搖床培養48 h，測定微藻生物量。根據生物量的增強情況考察藻細胞對不同抗生素的耐受范圍。每組試驗3個平行樣。

1.4.3.2抗生素對細菌治理試驗。根據藻細胞耐受性試驗結果，選擇對藻細胞無明顯負作用的抗生素進行細菌治理效果試驗，最終選擇既具有細菌治理效果又不影響藻細胞自身特性的抗生素種類。

污染藻液分裝到各組試驗組的玻璃板式反應器中，每組試驗3個平行樣，每組反應器中加入800 mL的污染藻液；并按照表1所示加入對應種類的抗生素和加量，在10 000 lx光強的人工光源下連續培養7 d，反應器中底部通入含有5%二氧化碳的空氣混合氣，將藻液pH控制在7.5～8.5；同時每天監控藻細胞濃度和細菌數量。

表1 抗生素添加

1.4.4慶大霉素的檢測。

1.4.4.1慶大霉素檢測法的制定——比濁法。配制10個濃度梯度(2、4、6、8、10 mg/L)的慶大霉素標準液，分別取3 mL各標準液于100 mL三角瓶；每個樣品3個平行。將提前活化至對數生長期的金黃色葡萄球菌稀釋至OD580為1的菌懸液，取3 mL菌液加入已滅菌的LB培養基和生理鹽水的培養體系中，并分裝至滅過菌的100 mL三角瓶中，每瓶27 mL；將分裝好的三角瓶于恒溫振蕩搖床上培養(搖床，140 r/min，37 ℃，避光)；在3 h時檢測菌液OD580。

1.4.4.2慶大霉素的去除。取20 L經慶大霉素治理后的藻液，經5 000 r/min離心5 min后，取離心清液開展試驗。各組試驗方法：①臭氧組。將臭氧發生器產生的穩定臭氧通過軟管導入玻璃柱式反應器底部，通過軟管連接的曝氣石向藻液通入臭氧氣體。試驗組依次為試驗5、試驗6、試驗7，分別通入臭氧0.5、1.0、2.0 h。②次氯酸鈉組。將含量10%有效氯的分析純次氯酸鈉溶液按照各組所需有效氯濃度折算取量。試驗組依次為試驗8、試驗9、試驗10，分別加入次氯酸150、500、1 000 μL/L。③臭氧+紫外組。臭氧通入方式同①中所述，紫外處理指同時將15 W的紫外燈管直接插入玻璃柱式反應器中直接紫外照射藻液。④有效氯+紫外組。在②的基礎上，同時將15 W的紫外燈管直接插入玻璃柱式反應器中直接紫外照射藻液。⑤紫外處理組。單獨使用15 W的紫外燈管直接插入玻璃柱式反應器中直接紫外照射藻液。

參照表2，分裝到內徑5 cm的玻璃柱式反應器中，每個反應器中裝800 mL。各試驗組處理完畢后均通入空氣20 min，以排除水中殘留的臭氧因素等干擾。處理后的樣品進行慶大霉素含量的檢測，采用比濁法測定，利用標準曲線確定慶大霉素含量。

表2 慶大霉素去除方法

1.4.5細菌污染治理方法驗證試驗。取20 L經慶大霉素治理后的藻液，混合均勻后直接分裝到內徑5 cm玻璃柱式反應器中，每個反應器中裝800 mL液體，每組3個平行樣。試驗設計：試驗16為向藻液中同時加入150 μL/L 次氯酸溶液和利用紫外燈處理0.5 h。同時陽性對照(CK7)為無菌狀態下的藻液，未經任何處理；陰性對照(CK8)為受到污染的藻液，不經過任何處理。以上試驗組均在避光條件下進行操作，試驗組通入空氣與二氧化碳的混合氣16 h，檢測慶大霉素殘留量，期間藻液避光。16 h后，給10 000 lx人工光，開始正常養殖5 d，每24 h進行OD檢測。

1.5生物量的測定[32-33]取一定體積量V的藻液先利用3 500 r/min 進行離心分離藻細胞和培養液，藻液中若有細菌此時由于其自身質量輕、形態小，將在培養液層存在；再加入5倍V體積量的一次水進行溶解藻泥層，待混勻后進行抽濾，此時將藻細胞截留在濾膜(恒定質量，m0)上，并用等體積量蒸餾水懸浮藻細胞3次，最后將濾膜于105 ℃的烘箱過夜至恒定質量，冷卻后稱量m1。細胞質量濃度(g/L)=(m1-m0) /V。

2 結果與分析

2.1不同抗生素對藻細胞生長的影響圖1為5種抗生素在3種濃度梯度下對眼點擬微綠球藻生長的影響程度。通過生物量生長數據對比可知，慶大霉素、四環素和紅霉素在200 mg/L以內對藻細胞無明顯的抑制作用;而青霉素在50 mg/L 時藻細胞就有較小的抑制作用，達到100 mg/L以上時對藻細胞抑制作用非常顯著；氯霉素在50 mg/L對藻細胞無明顯的抑制作用，當濃度達到100 mg/L以上時對藻細胞的抑制隨著濃度的增加而顯著提高。

圖1 不同抗生素對眼點擬微綠球藻細胞生長的影響 Fig.1 Effect of different antibiotics on the growth of Nannochloropsis oculata cells

2.2不同抗生素對藻液細菌污染治理方法的研究由圖2可知，污染藻液的陰性對照組(CK1組)未經任何處理，其藻細胞經過幾日的連續培養，藻細胞逐漸大幅死亡，同時藻液中明顯短桿狀細菌增加。硫酸慶大霉素處理組(試驗組1)和四環素處理組(試驗組2)，污染的藻細胞生長狀態良好；其中試驗組1藻細胞生長狀態與空白對照組(CK2組)生長狀態相當；試驗組2前期抑菌效果明顯，藻細胞生長狀態良好，但后期抑菌效果差，細菌又得到大量繁殖，藻細胞生長受到明顯的影響。紅霉素處理組(試驗組3)對導致藻細胞死亡的細菌無明顯的治理作用，其試驗組3藻細胞初期就開始死亡，細胞濃度呈現快速下降趨勢。在選用的3種抗生素中，對導致擬微綠球藻死亡的細菌，有效的抗生素有慶大霉素，四環素短期有效，紅霉素對該類細菌無抑制效果。

圖2 不同抗生素對眼點擬微綠球藻的細菌污染治理情況對比Fig.2 Comparison of bacterial contamination control of Nannochloropsis oculata with different antibiotics

2.3慶大霉素去除方法的研究

2.3.1硫酸慶大霉素檢測標準曲線測定結果。圖3為以LB培養基作為金黃色葡萄球菌的培養體系、加入低濃度慶大霉素標準液(2、4、6、8、10 mg/L)培養3 h后檢測的OD580結果。從圖中可以看出，培養3 h后，菌懸液OD均與慶大霉素標準品中的慶大霉素濃度呈線性關系，且慶大霉素濃度越高，菌懸液OD越低，即慶大霉素濃度越高，對金黃色葡萄球菌的滅殺性越好，細菌的增長量越低。根據線性擬合結果Y=-6.355 7X+11.351 0(R2=0.991 7)可知，3 h時檢測結果的線性關系良好。因此，利用比濁法檢測水中慶大霉素時，應以LB培養基作為細菌的培養體系，培養3 h時進行檢測的效果較好，且只能對低濃度的慶大霉素進行檢測(檢測范圍為2～10 mg/L)，對于高濃度的待測樣品可進行適當倍數的稀釋處理。

圖3 測試樣品中慶大霉素濃度變化Fig.3 Change of gentamicin concentration in the test sample

2.3.2慶大霉素去除方法的比較。各試驗組的出水慶大霉素濃度和慶大霉素去除率見圖4。根據檢測結果可知，試驗5(臭氧處理0.5 h)水樣中慶大霉素濃度約為13.40 mg/L，去除率為81.83%；臭氧處理1.0 h組(試驗組6)、臭氧處理2.0 h組(試驗組7)水樣中慶大霉素濃度分別為12.78和3.80 mg/L，折合去除率分別為82.69%和94.84%。臭氧氧化法去除水中慶大霉素具有一定穩定性和可應用性，隨著作用時間的增加，慶大霉素的去除率可達到95%左右。而CK3對照組慶大霉素去除率為97.11%，表明藻液中通入臭氧后再經過20 min的曝氣將過多的臭氧去除的方法對細菌無明顯的致死作用，而且也消除了可能殘留的臭氧氣體對慶大霉素的干擾。

用一定濃度的有效氯氧化去除水中慶大霉素時，去除效果受有效氯添加量影響嚴重。15 mg/L有效氯組(試驗組8)水樣中慶大霉素濃度為34.23 mg/L，去除率為53.60%；50 mg/L 有效氯組(試驗組9)水樣中慶大霉素濃度為25.73 mg/L，去除率為65.12%；100 mg/L有效氯組(試驗組10)水樣中慶大霉素濃度為1.98 mg/L，去除率為97.31%，即添加有效氯的量低于50 mg/L時對慶大霉素去除效果較差，當添加的有效氯達到100 mg/L時，水樣中慶大霉素含量降至1 mg/L以下時去除效果較好；且通過對CK4對照組結果可知，有效氯的加入對慶大霉素濃度的檢測結果基本無影響。

圖4 慶大霉素的化學方法去除對比Fig.4 Comparison of chemical removal of gentamicin

在圖4方法的基礎上，慶大霉素去除方法的使用過程中又增加了紫外照射的方法，2種方法結合對慶大霉素的去除效果如圖5所示。根據檢測結果可知，臭氧+紫外處理0.5 h組(試驗組11)水樣中慶大霉素濃度為2.30 mg/L，去除率達到97.41 %；15 mg/L有效氯+紫外處理0.5 h組(試驗組12)水樣中慶大霉素濃度為8.51 mg/L，去除率達到90.44%；50 mg/L有效氯+紫外處理0.5 h組(試驗組13)水樣中慶大霉素濃度為6.13 mg/L，去除率達到93.12%。2種方法的組合使用比單獨每一種方法的去除效果明顯。而單獨使用紫外處理其慶大霉素的去除效果較差，紫外處理0.5 h組(試驗組14)和紫外處理1.0 h(試驗組15)的慶大霉素去除率分別為32.61%和67.99%。

圖5 慶大霉素的物理方法去除對比Fig.5 Comparison of the physical methods of gentamicin removal

2.3.3細菌污染治理驗證試驗。慶大霉素的去除方法研究表明，有效氯和紫外照射這2種方法的共同作用對樣品中慶大霉素的去除具有很好的作用。但“2.3.2”中研究方法是將藻液中的藻細胞利用離心方式去除，僅針對離心后的清液水體進行的方法研究。為此，在藻液中的應用也進行了研究，證實該方法在去除慶大霉素的同時，又對藻細胞本身無明顯的負作用。

圖6 藻液中慶大霉素去除方法對養殖的影響情況Fig.6 Effect of gentamicin removal method on culture in algae solution

由藻液中慶大霉素去除方法對養殖影響情況對比(圖6)可知，CK7對照組與CK8對照組藻細胞生長情況相當，說明在慶大霉素治理藻細胞細菌污染時，慶大霉素的治理效果很好，治理后的藻細胞保持與無污染正常狀態下藻細胞相同的生長狀態；而試驗組16在慶大霉素去除的試驗前期藻細胞生長遲緩，藻細胞第1天負增長，從第2天開始逐漸恢復，說明慶大霉素去除方法中的15 mg/L有效氯對藻細胞具有一定的損傷，隨著養殖天數的增加，藻細胞形狀逐漸恢復，生長趨于正常。治理后的第2天，測定藻液中的慶大霉素含量，CK8的慶大霉素含量為80.15 mg/L，通過有效氯和紫外2種方法一同處理的試驗組16中慶大霉素含量為5.05 mg/L，則慶大霉素的去除率為93.70%。

3 討論與結論

該研究過程中，首先通過藻細胞對5種抗生素的耐受性選擇，選定3種抗生素；并對3種抗生素對污染藻液進行污染治理效果的篩選，確定出硫酸慶大霉素對眼點擬微綠球藻中致死菌具有很好的滅殺作用，并可將受到細菌污染的藻液治愈成生長速度正常的藻細胞，有利于微藻的持續養殖。該試驗選出的最佳試劑為慶大霉素，參考劉曉娟等[26]給出的慶大霉素對眼點擬微綠球藻細胞的生長抑制率為8.95%的結論，可以初步確定硫酸慶大霉素對藻細胞負作用較低，而且對細菌具有良好的致死作用。該方法有利于戶外連續養殖的穩定性。雖然硫酸慶大霉素對藻液中致死菌具有較好的殺滅作用，但硫酸慶大霉素畢竟是一種抗生素，如果將殘留慶大霉素的水體外排將嚴重污染環境[24]。因此該研究考察幾種方法單獨處理慶大霉素的作用效果，以及2種方法聯合處理慶大霉素的作用效果。

從試驗數據可知，單獨使用治理方法中，通入臭氧2 h和100 mg/L高濃度有效氯的方法對慶大霉素的去除效果最好，去除效率可達到97%以上。雖然慶大霉素的去除率很高，但由于單獨方法中單一方法使用藥劑的劑量或作用時長較大，對藻細胞的損傷很大，有些劑量最嚴重可導致藻細胞死亡，因此這些方法不適宜對慶大霉素處理后的藻液再進行慶大霉素的去除。但是單一的去除方法作用簡單、操作簡便、慶大霉素去除率高，這些優點可將該方法應用于去除藻細胞后的清液的慶大霉素的去除，將清液中的慶大霉素含量盡可能地降到最低，為抗生素的深入去除奠定基礎。

在2種方法聯合處理慶大霉素方面：臭氧0.5 h+紫外0.5 h和15 mg/L有效氯+紫外0.5 h，這2種聯合作用方法在去除慶大霉素方面效果最好，去除率可達90%以上。上述方法均可應用到藻液中，但臭氧較長時間通入到藻液中，會對藻細胞產生較為嚴重的負影響。該試驗中所采用的15 mg/L有效氯+紫外0.5 h的方法是非常有效的一種去除藻細胞中慶大霉素殘留的方法，雖然應用前期也存到一些負影響，其原因是有效氯對藻細胞的作用導致藻細胞受到一定損傷，但藻細胞性狀很快就能得到恢復，達到之前的生長速度，因此該方法可作為室內外養殖的藻種環節針對該類細菌污染時的一種有效的治理方法，也為微藻穩定養殖提供細菌污染治理方面的數據積累和技術支持，為眼點擬微綠球藻的穩定養殖提供一種有效的治理細菌污染的方法，促進該藻株的穩定養殖及產業化推廣，有助于EPA飼料產業及EPA產品市場的發展。