肌紅蛋白在納米金—石墨烯復合材料修飾電極上的電化學研究

何博琳，汪曉玲，門永玲，謝 慧，羅貴鈴，牛燕燕，孫 偉

(海南師范大學 化學與化工學院 海口市功能材料與光電化學重點實驗室，海南 海口 571158)

利用納米材料制備化學修飾電極具有比表面積大、導電性高等特點，有利于加快電子轉(zhuǎn)移速度[1]。石墨烯(Graphene)是由單層碳原子緊密堆積而成、呈二維蜂窩狀晶格結(jié)構(gòu)的新型碳材料，具有優(yōu)異的電學、熱學和力學等性能，其平面結(jié)構(gòu)為負載納米金屬提供了足夠的表面，相應(yīng)的石墨烯復合材料性能有更大的提高[2]。納米金具有高比表面積、強吸附性以及良好的導電性和生物相容性等，可以將生物分子有效地固定且不影響其生物活性，在電化學分析和電化學生物傳感器中得到了廣泛的應(yīng)用[3]。

本文利用負載納米金粒子石墨烯(rGO@Au)制備了肌紅蛋白(Mb)電化學傳感器。該納米復合材料展示了納米金與石墨烯良好的協(xié)同作用，Mb在傳感界面上得到良好的固定并且保持其生物活性。實驗結(jié)果表明rGO@Au具有良好的生物相容性，有效加快Mb的電子轉(zhuǎn)移，所制備的電化學傳感器對三氯乙酸表現(xiàn)出良好的催化效果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

JSM-7100F熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社)；CHI 660D型電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)。負載金屬納米金粒子石墨烯(rGO@Au，南京先豐納米科技有限公司)；肌紅蛋白(Mb，Sigma公司)；N-己基吡啶六氟磷酸鹽 (HPPF6，蘭州雨陸精細化工有限公司)；石墨粉(上海膠體化工廠)；三氯乙酸(TCA，天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心)；5% Nafion (北京鴻海天科技有限公司)。

1.2 Nafion/Mb-rGO@Au/CILE的制備

將石墨粉和HPPF6混合均勻?qū)氩Ａщ姌O管中，內(nèi)插銅絲為導線，得到碳離子液體電極(CILE)[4]。配制含rGO@Au濃度為0.6 mg/mL和Mb濃度為15.0 mg/mL的混合液，取6 μL涂布于CILE上室溫干燥后進一步滴涂8 μL 0.5% Nafion溶液，自然晾干后制得Nafion/Mb-rGO@Au/CILE。

2 結(jié)果與討論

2.1 電極表征結(jié)果

用掃描電鏡記錄rGO@Au的形貌結(jié)果如圖1(A)所示，可以看出典型的石墨烯片狀構(gòu)型，并在其表面均勻分散納米金顆粒。這種結(jié)構(gòu)增大了電極界面的比表面積，有利于Mb在電極表面的固定及其與電極之間的電子傳遞。電化學交流阻抗譜 (EIS) 結(jié)果圖1(B)所示，Nafion/Mb/CILE (曲線a)的阻值為57.97 Ω，而Nafion/Mb-rGO@Au (曲線b)的阻值為39.05 Ω，電阻值明顯的減小說明rGO@Au復合材料有高導電性，有效加快電子轉(zhuǎn)移。

圖1 (A)為rGO@Au的SEM圖，(B)為Nafion/Mb/CILE(a)和Nafion/Mb-rGO@Au/CILE(b)在10.0 mmol/L鐵氰化鉀和0.1 mol/L氯化鉀混合液中的電化學交流阻抗譜

Fig.1 (A) SEM of rGO@Au; (B) EIS results of (a) Nafion/Mb/CILE and (b) Nafion/Mb-rGO@Au/CILE

2.2 Mb的直接電化學行為

圖2(A)為在pH 5.0 PBS緩沖液中不同修飾電極的循環(huán)伏安曲線。在Nafion/CILE (曲線a)和Nafion/rGO@Au/CILE (曲線b)上沒有出現(xiàn)氧化還原峰，表明電極上不存在電活性物質(zhì)，背景電流的增大說明具有片狀結(jié)構(gòu)的rGO@Au增加了雙電層電容。在Nafion/Mb/CILE (曲線c)上有一對較小的氧化還原峰出現(xiàn)，表明Mb與電極間存在較慢的電子轉(zhuǎn)移。而Nafion/Mb-rGO@Au/CILE (曲線d)上出現(xiàn)了一對較為對稱且準可逆的氧化還原峰，表明rGO@Au在電極表面使得電極反應(yīng)更為可逆，高導電性的rGO@Au加快Mb的電子轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的直接電化學。

探討了掃速對Mb直接電化學響應(yīng)的影響。如圖2(B)所示，在20～900 mV/s掃速范圍內(nèi)Mb均表現(xiàn)出了一對氧化還原峰。掃速的增大會引起峰電流的增大，兩者間呈線性關(guān)系，表明修飾電極上發(fā)生了吸附控制的薄層電化學行為。由公式Q = nAFΓ*計算出電活性物質(zhì)表面覆蓋度Γ*= 3.54×10-10mol/cm2，較之單層覆蓋量(1.58×10-11mol/cm2)更高[5]。隨著掃速的加快峰電位差也逐漸增大，其線性方程為Epc (V) = 0.056 ln υ (V/s) - 0.12 (n = 8, γ = 0.969)和Epa (V) = -0.045 ln υ (V/s) - 0.34 (n = 8, γ = 0.988)。根據(jù)Laviron理論[6]，求解了電子轉(zhuǎn)移數(shù)n = 1.02，電子傳遞系數(shù)α = 0.56。反應(yīng)速率常數(shù)ks = 0.72 s-1，較之其他文獻值如CS-GR-IL/CILE (0.65 s-1)[7]，GR-Pt/CILE (0.58 s-1)[8]更大，說明rGO@Au修飾電極中Mb的直接電子轉(zhuǎn)移具有較快反應(yīng)速率。

圖2 (A)不同修飾電極在pH值5.0 PBS緩沖液中，掃速為0.1 V/s的循環(huán)伏安曲線； (B)不同掃速下的循環(huán)伏安圖

Fig.2 (A) CVs of (a) Nafion/CILE, (b) Nafion/rGO@Au/CILE, (c) Nafion/Mb/CILE, (d) Nafion/Mb-rGO@Au/CILE in pH 5.0 PBS with the scan rate as 100 mV/s; (B) CVs of Nafion/Mb-rGO@Au/CILE with different scan rates

2.3 修飾電極的電催化應(yīng)用

a 到 p為0.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 80.0, 90.0, 100.0, 110.0, 120.0, 130.0 mmol/L

考察了修飾電極電催化還原TCA的效果。如圖3所示，當TCA濃度在3.0～130.0 mmol/L范圍內(nèi)，Ipc隨其濃度的增大而增大，Ipa則逐漸減少至消失，得到線性方程為Ipc (mA) = 0.0028 C (mmol/L) +0.049 (n = 11, γ = 0.995)。當TCA濃度大于130.0 mmol/L時出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點，為Michaelis-Menten動力學過程的典型特征[9]。根據(jù)Lineweaver-Burk方程，計算出修飾電極對TCA催化反應(yīng)的表觀米氏常數(shù)(KMapp)為7.60 mmol/L，檢測限為0.63 mmol/L (3σ)。

2.4 樣品的測定

根據(jù)標準加入法將修飾電極用于對醫(yī)用換膚液(上海伊卡生物技術(shù)有限公司)中TCA含量的檢測，結(jié)果如表1所示，回收率在95.10 %～103.07 %范圍內(nèi)，證明修飾電極對TCA樣品測定具有較高的準確率。

表1 醫(yī)用換膚液中TCA的檢測結(jié)果 (n=3)

3 結(jié)論

通過直接涂布法制備Mb與rGO@Au修飾電極，并研究了Mb在復合膜內(nèi)的電化學行為。循環(huán)伏安掃描結(jié)果表現(xiàn)為一對準可逆的氧化還原峰，修飾了rGO@Au納米復合材料后提升了Mb與電極間的電子轉(zhuǎn)移速率。進一步探討了影響膜內(nèi)Mb電化學響應(yīng)的的因素，求解了相關(guān)的電化學參數(shù)，并應(yīng)用于對三氯乙酸(TCA)電催化還原，結(jié)果較為滿意。