紫外-可見分光光度法測定沙棘葉總黃酮 含量的優化試驗

梁愛軍

(1.山西省林業科學研究院，山西 太原 030012;2.國家林業局沙棘工程技術研究中心，山西 太原 030012))

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)，胡頹子科沙棘屬落葉灌木，由于其耐旱、抗風沙的特性，被廣泛應用于水土保持造林中。沙棘是一種重要的藥食同源植物，其根、葉、花、果實、種子中含有黃酮、原花青素、維生素等多種營養成分，特別是沙棘葉中的黃酮類物質遠大于其它部位，被廣泛應用于食品、醫藥、化妝品等多個領域。現代醫學表明，沙棘黃酮具有抑制動脈粥樣硬化、降低血脂膽固醇水平、延緩衰老等作用。沙棘葉總黃酮的測定方法主要有分光光度法與高效液相色譜法。高效液相色譜法主要用于測定黃酮單體成分，具有精確度高、誤差小的優點，但操作復雜、檢測成本較高。分光光度法主要用于測定總黃酮含量，一般采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH為顯色體系，但對于NaNO2，Al(NO3)3，NaOH的加入量與顯色時間的文獻報道均不一致。因此，筆者對沙棘葉樣品溶液中總黃酮含量進行分析比較，以期建立最優的測定沙棘葉總黃酮含量的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘葉采自山西省關帝林局龍興林場(5月至10月混合)；蘆丁、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑皆為市售國產分析純。

儀器有電子天平(青島紫泉儀器有限公司)，鼓風干燥箱(上海博訊有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(上海博訊有限公司)，紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)，臺式離心機(賽歐斯天津科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理

將沙棘葉于60 ℃鼓風干燥箱中干燥6 h，粉碎機粉碎，過80目篩后備用。

1.2.2 樣品溶液的制備

精確稱取5 g沙棘葉粉末，加60%乙醇50 mL，水浴加熱2 h，離心過濾，定容至100 mL容量瓶中。之后再從容量瓶中取25 mL液體定容到50 mL容量瓶中備用。

1.2.3 空白參比的選擇

將樣品溶液、5%NaNO2溶液、10%Al(NO3)3溶液、4% NaOH溶液以不同組合方式，用30%乙醇定容至25 mL容量瓶中，于510 nm處測定吸光度值。

1.2.4 稀釋定容乙醇濃度的選擇

精確吸取1 mL樣品溶液于25 mL容量瓶中，分別用30%，40%，50%，60%，70%乙醇定容，于510 nm處測定吸光度值。

1.2.5 顯色劑加入量的選擇

精確吸取1 mL樣品溶液于25 mL容量瓶中，每次只改變一個劑量因素，用30%乙醇定容，于510 nm處測定吸光度值。

1)加入4%NaNO2溶液0.3 mL，0.5 mL，0.7 mL，1.0 mL，10%Al(NO3)3溶液1 mL，4%NaOH溶液10 mL.

2)加入4%NaNO2溶液1 mL，10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，0.5 mL，0.7 mL，1.0 mL，4%NaOH溶液10 mL.

3)加入4%NaNO2溶液1 mL，10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，4%NaOH溶液4 mL，6 mL，8 mL，10 mL.

1.2.6 顯色時間的選擇

精確吸取1 mL樣品溶液于25 mL容量瓶中，每次只改變一個靜置時間因素，用30%乙醇定容，于510 nm處測定吸光度值。

1)加入4% NaNO2溶液1 mL，靜置2 min，4 min，6 min，8 min，10 min；10% Al(NO3)3溶液1 mL，靜置6 min；4% NaOH溶液10 mL，靜置15 min.

2)加入4% NaNO2溶液1 mL，靜置6 min；10% Al(NO3)3溶液1 mL，靜置2 min，4 min，6 min，8 min，10 min；4% NaOH溶液10 mL，靜置15 min.

3)加入4% NaNO2溶液1 mL，靜置6 min；10% Al(NO3)3溶液1 mL，靜置6 min；4%NaOH溶液10 mL，靜置5 min，10 min，15 min，20 min，25 min.

1.2.7 標準曲線的制作

配置0.2 mg/mL蘆丁標準溶液，分別吸取0 mL，1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6 mL.之后加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻靜置6 min.再加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻靜置6 min.再加4%NaOH溶液10 mL，用30%乙醇定容至刻度，搖勻靜置15 min，于510 nm處測定吸光度。以X軸為蘆丁濃度，Y軸為吸光度，制作標準曲線。

1.2.8 沙棘葉總黃酮的計算

式中：w——沙棘葉總黃酮含量，mg/g；

c——根據標準曲線計算的沙棘葉總黃酮濃度，mg/mL；

v——提取液總體積，mL；

d——稀釋倍數；

m——沙棘葉粉末質量，g.

2 結果與分析

2.1 空白參比的選擇

不同空白參比的吸光度見圖1.

圖1 不同空白參比的吸光度

由圖1可以看出，試劑空白亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉組(B+C+D)的吸光度值最低。由于樣品本身有顏色，試劑空白不能排除樣品中色素及一些其它有色雜質的吸光度，會導致結果偏高。樣品溶液-亞硝酸鈉組(A+B)、樣品溶液-硝酸鋁組(A+C)的吸光度稍大于樣品溶液組(A)的吸光度，表明單獨加入亞硝酸鈉或硝酸鋁與樣品溶液中的少部分黃酮類物質發生反應。樣品溶液-亞硝酸鈉-硝酸鋁組(A+B+C)的吸光度與樣品測定(A+B+C+D)的吸光度基本接近，表明同時加入亞硝酸鈉與硝酸鋁與樣品溶液中的大部分黃酮類物質發生絡合反應。因此，選擇樣品溶液組(A)作為空白參比較好。

2.2 稀釋定容乙醇濃度的選擇

不同稀釋定容乙醇濃度的吸光度值見圖2.

圖2 稀釋定容不同乙醇濃度的吸光度

由圖2可知，用30%，40%，50%，60%乙醇定容的吸光度值基本相近，因此乙醇濃度對該方法的最終顯色影響不是很大。用70%乙醇定容的吸光度值稍高一些，可以選用70%乙醇稀釋定容。

2.3 顯色劑加入量的選擇

顯色劑加入量對吸光度值的影響見表1.

表1 顯色劑加入量對吸光度值的影響

由表1可以看出，顯色劑NaNO2，Al(NO3)3，NaOH的不同加入量對吸光度值的影響不顯著，說明顯色劑加入量的多少不影響吸光度值。為了節約試劑，選擇NaNO20.3 mL，Al(NO3)30.3 mL，NaOH 4 mL.

2.4 顯色時間的選擇

顯色劑顯色時間對吸光度值的影響見表2.

表2 顯色劑顯色時間對吸光度值的影響

由表2可知，NaNO2靜置時間對試驗結果基本無影響，所以加入NaNO2后可直接加入Al(NO3)3，不必再搖勻靜置。加入Al(NO3)36 min后，吸光度值趨于穩定，說明Al(NO3)3與黃酮類化合物的絡合反應至少需要6 min才能完成。加入NaOH 10 min～15 min吸光度值基本沒變化，靜置25 min吸光度值減小。因此，加入NaOH后搖勻靜置10 min即可，最長靜置20 min.

2.5 標準曲線的制作

通過測定蘆丁標準溶液的吸光度值，繪制蘆丁標準曲線，見圖3.

圖3 蘆丁標準曲線

2.6 沙棘葉總黃酮含量的測定

在上述得出的最優條件下進行3次平行測定，取1 mL樣液于25 mL容量瓶中，加入5% NaNO20.3 mL，加入10% Al(NO3)30.3 mL，搖勻靜置6 min.然后加入4% NaOH 4 mL，搖勻靜置10 min，用70%乙醇定容至刻度。以只加樣品溶液為空白參比，于510 nm處測定吸光度值，得到沙棘葉總黃酮提取率為1.94%，1.99%，2.10%，平均提取率為2.01%.

3 討論

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系分光光度法測定沙棘葉總黃酮含量時，空白參比、稀釋定容乙醇的濃度、試劑加入量與顯色時間對測定結果均有一定影響。因此，必須嚴格保證空白參比、稀釋定容乙醇的濃度、試劑加入量與顯色時間等試驗環節前后完全一致，否則會導致結果偏高或偏低，出現較大的誤差。