不同提取方法對沙棘葉總黃酮含量的影響

劉英翠

(1.山西省林業(yè)科學研究院，山西 太原 030012;2.國家林業(yè)局沙棘工程技術研究中心，山西 太原 030012)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

試驗所用沙棘葉采自山西省右玉縣，干燥粉碎后過80目篩密封備用。

1.1.2 儀器

超聲波清洗器(KQ-200VDE)，紫外可見分光光度計(上海儀電UV-752N)，分析天平(AEG-80SM)，離心機(Centrisart D-16C)，水浴鍋(CS501)，電熱鼓風干燥箱(GZX-9070MBE)。

1.1.3 試劑

蘆丁標準品(成都思科華生物技術有限公司)，乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等試劑(分析純)，復合酶(由纖維素酶與果膠酶組成)。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確稱取蘆丁標準品10 mg，用30%乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，得濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準品溶液。

1.2.2 標準曲線的繪制

分別吸取蘆丁標準品溶液0 mL，1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6 mL，加入5% NaNO2溶液1 mL，搖勻靜置6 min.再加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻靜置6 min.再加4% NaOH溶液10 mL，最后用30%乙醇定容至刻度，搖勻靜置15 min.以試劑作為空白參比，在最大吸收波長500 nm處測定吸光度(見表1)。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線(圖1)，得到回歸方程：

y=11.691 0 x+0.007 8，R2=0.999 7.

圖1 蘆丁標準曲線

1.2.3 黃酮的提取

1.2.3.1 水回流提取法

準確稱取干燥的沙棘葉粉末2 g于燒瓶中，加入蒸餾水30 mL，水浴回流提取2次，每次2 h，提取溫度85 ℃.合并2次濾液于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即得供試溶液A.

1.2.3.2 乙醇回流提取法

精確稱取干燥的沙棘葉粉末2 g于燒瓶中，加入60%乙醇30 mL，水浴回流2次，每次2 h，水浴溫度60 ℃，冷卻后過濾。收集濾液于100 mL容量瓶中，殘渣用60%乙醇洗滌，洗液并入容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻。量取25 mL液體置于50 mL的容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，即得60%乙醇回流提取液B.

1.2.3.3 酶輔助乙醇提取法

精確稱取沙棘葉粉末2 g于燒瓶中，加入60%乙醇30 mL，酶用量為沙棘葉質量的4%，置熱水浴中120 min，溫度50 ℃，冷卻后過濾于100 mL容量瓶中。殘渣用60%乙醇洗滌，洗液并入容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻。取25 mL液體置于50 mL的容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，即得酶輔助乙醇提取液C.

1.2.3.4 超聲輔助乙醇提取法

精確稱取沙棘葉粉末2 g于燒瓶中，按液料比10∶1加入60%乙醇后進行超聲波處理，超聲功率80 W，提取溫度50 ℃，提取時間60 min.離心10 min，用濾紙過濾于100 mL容量瓶中，殘渣用60%乙醇洗滌，洗液合并于容量瓶中，用60%乙醇定容。取25 mL置于50 mL的容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，即得超聲輔助乙醇提取液D.

1.2.4 樣品含量的測定

分別量取供試品溶液A，B，C，D各1.5 mL于25 mL容量瓶中，加入30%乙醇4.5 mL，5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻，靜置6 min.后加10%硝酸鋁1 mL，混勻，放置6 min.再加入4%氫氧化鈉10 mL，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min.用紫外分光光度法于波長500 nm處測定吸光度，計算黃酮提取率。每種提取方法做3次平行試驗，取平均值。

2 結果與分析

4種提取法所得沙棘葉總黃酮含量及提取率見表2和第23頁圖2.

表2 不同提取法沙棘葉黃酮的提取率

圖2 不同提取法沙棘葉黃酮的提取率比較

由表2和圖2可知，乙醇回流法黃酮提取率最高，為7.58%.該方法成本較低，提取率高，但提取時間太長。水回流法提取黃酮雜質較多，如無機鹽、蛋白質、糖等，因此提取率最低，為2.57%.溶劑回流提取法主要是利用乙醇和水的擴散、滲透作用，逐漸通過沙棘葉細胞壁滲透到細胞內(nèi)，將黃酮類物質溶出。而黃酮類化合物易溶于乙醇等有機溶劑，在乙醇中的溶解度大于在水中的溶解度，乙醇可以將黃酮類物質近于完全溶出。因而，乙醇回流法提取到的黃酮含量最高。

酶輔助乙醇法黃酮提取率為6.75%，略低于乙醇回流法。這是由于酶具有專一性，復合酶可在纖維素酶、果膠酶等的協(xié)同作用下，破壞沙棘葉的細胞壁，使細胞內(nèi)的黃酮類物質裸露出來，有利于次生代謝產(chǎn)物黃酮類物質的溶解。酶輔助乙醇法提取沙棘葉總黃酮是一種較新的提取方法，提取率比傳統(tǒng)的乙醇回流法略低，但該法可減少有機溶劑使用量，簡化提取流程。

超聲輔助乙醇提取法黃酮的提取率為4.63%，低于酶輔助乙醇提取法。超聲輔助主要是利用超聲波產(chǎn)生的強烈震動、高速的空化效應和攪拌作用，破壞沙棘葉細胞，使提取液乙醇滲透到沙棘葉細胞內(nèi)，加速黃酮類物質的浸出。由表2可以看出，超聲波提取法大大節(jié)省了提取時間，是溶劑回流提取時間的1/4，且具有有機溶劑用量少的特點，但提取率較乙醇回流與酶輔助乙醇提取法低。

3 結論

研究表明，不同的提取方法直接影響著沙棘葉黃酮的提取率。傳統(tǒng)的乙醇回流法對沙棘葉總黃酮的提取率最大，具有設備簡單、提取率高等優(yōu)點，但溶劑消耗量大，耗時耗能，且過高的水浴溫度是否對黃酮活性成分造成破壞還有待進一步研究。酶輔助乙醇法提取沙棘葉總黃酮具有提取率高、操作簡單，省時省力、溶劑用量少、耗能低、易于工業(yè)化等優(yōu)點。因此，生物酶法在沙棘葉黃酮提取上具有明顯優(yōu)勢，這將為沙棘葉的開發(fā)利用提供新的方法和思路，為今后生產(chǎn)沙棘葉黃酮提供良好的工業(yè)化前景。

分析得出酶輔助乙醇法提取沙棘葉黃酮的最佳試驗條件為：酶與沙棘葉質量比為1∶0.04，水浴溫度50 ℃，提取時間120 min，乙醇濃度60%，提取次數(shù)1次。在此條件下沙棘葉黃酮提取率為6.75%.