住院患兒臨床分離碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌分子流行病學特征

鄒翠美， 馬瑞林， 胡付品， 朱泳璋， 任 崢

近年來，碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）的檢出率上升明顯[1-3]，引起醫療衛生領域的高度關注。由于不同地區CRKP產生的碳青霉烯酶類型不同，可能與各地區使用抗菌藥物種類不同有關[4]，特別是兒童疾病中以感染性疾病居多，是抗菌藥物應用最多的群體，兒童患者由于免疫力較低更容易感染CRKP[5]。因此，研究銀川市第一人民醫院（我院）內兒童患兒中CRKP的分子流行特征，對遏制其流行播散有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌 收集我院2014－2016年所有新生兒病區（NICU）和普通兒科病房患者CRKP菌株共16株，剔除同一患者分離的重復菌株。

1.1.2 培養基及抗菌藥物 哥倫比亞瓊脂和Mueller-Hinton瓊脂購自英國OXOID公司，常規使用自動化儀器法和紙片擴散法進行藥敏試驗，藥敏紙片購自英國OXOID公司，復核使用的亞胺培南E試驗條和美羅培南E試驗條為英國OXOID公司的微生物藥敏試紙。

1.2 方法

1.2.1 細菌鑒定和藥敏試驗 細菌鑒定藥敏試驗采用BD公司的phoenix 100全自動鑒定藥敏系統及其配套試劑。參照2016年CLSI推薦的微量肉湯稀釋法測定16株菌對抗菌藥物敏感性，結果判讀按照CLSI 2016年折點標準。藥敏試驗質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，來自衛計委臨床檢驗中心。

1.2.2 碳青霉烯酶表型及基因型檢測 3'-氨基苯硼酸（APB）和乙二胺四乙酸（EDTA）協同試驗表型檢測肺炎克雷伯菌中的碳青霉烯酶。含EDTA或APB厄他培南與單厄他培南抑菌圈直徑相差≥5 mm提示產金屬酶或KPC型碳青霉烯酶。PCR法擴增碳青霉烯酶（KPC、 NDM、IPM、VIM）、AmpC酶（MOX、CIT、DHA、ACC、EBC、FOX ）、超廣譜β內酰胺酶（ESBL）（CTX-M、OXA）和TEM型β內酰胺酶基因，所用引物參考相應文獻[6-8]。PCR陽性產物經DNA測序并分析具體基因型別。

1.2.3 接合試驗 選用對利福平耐藥的大腸埃希菌EC600作為受體菌，CRKP作為供體菌進行質粒接合試驗。供體菌和受體菌分別在MH肉湯中培養后，按照1∶1混合后加入新鮮的MH肉湯中，靜置 35 ℃孵育18～20 h，取100 μL混合液涂布在含600 mg/L利福平和25 mg/ L氨芐西林的MH篩選平皿上孵育18～24 h，在含藥平皿上挑取單個菌落接種到CHROMagar顯色平皿上判斷是否為接合子，對接合子進行目的基因PCR 擴增及藥敏試驗。

1.2.4 脈沖場凝膠電泳（PFGE） 采用PFGE對16株CRKP進行同源性分析，菌株經Xba I酶切后包埋于1%瓊脂糖凝膠中，在無硫脲的含0.5×Tris-硼酸（TBE）緩沖液中進行PFGE，沙門菌H9812為參考菌株。酶切圖譜按照美國CDC TENOVER等推薦的方法判讀[9]。

1.2.5 數據分析 采用WHONET 5.6軟件進行數據分析。

2 結果

2.1 細菌

16株CRKP中，13株分離自新生兒患者，3株分離自普通兒科患者，年齡范圍2 d～3個月。4株來自血標本、11株來自痰標本、1株來自氣管導管末端標本。

2.2 藥敏試驗

16株CRKP對多黏菌素E、阿米卡星、環丙沙星100%敏感，對頭孢菌素類、碳青霉烯類藥物100%耐藥，對哌拉西林-他唑巴坦11.1%敏感。基因測序結果顯示，6株金屬β內酰胺酶基因陽性，包括2株blaNDM-16、2株blaIPM-34和2株blaIPM-4，其余10株均未檢出碳青霉烯酶基因，而檢出blaCTX-M（CTX-M-65、CTX-M-3、CTX-M-15）和AmpC酶（DHA-1）的耐藥基因。見表1。

2.3 CRKP耐藥基因水平傳播及分子流行病學

接合試驗：將未檢出碳青霉烯酶B類金屬酶的CRKP抽取2株做供體菌，與受體菌EC600接合，接合后經PFGE證實，EC600獲得耐藥質粒，其藥敏結果也與供體菌一致。

2.4 臨床信息

入院患兒分布：13例新生兒病例中早產兒7例，窒息3例，肺炎1例，先天性心臟病1例，發熱待查1例；3例普兒科患兒中2例重癥肺炎，1例支氣管炎。抗菌藥物使用情況，普兒科、NICU基本

首選頭孢他啶、頭孢呋辛、阿莫西林-克拉維酸、青霉素；嚴重感染患兒或是檢出CRKP則使用美羅培南，未使用過其他類抗菌藥物，其中1例先天性心臟病患兒痰分離出CRKP未使用抗菌藥物。患兒轉歸情況，16例患兒14例好轉出院，2例放棄治療出院。16例患兒臨床信息見表2。

表1 16株CRKP基因型及對常用抗菌藥物的藥敏試驗結果Table 1 MICs of selected antimicrobial agents against 16 carbapenem-resistant K. pneumoniae strains and the corresponding genotype（mg/L）

表2 16例患兒臨床信息Table 2 Clinical data of 16 pediatric patients

2.5 同源性分析

PFGE顯示，16株CRKP共發現6個克隆株，其中 A 型5株、C 型4株、B 型3株、D型2株、E型和F型各1株。部分菌株PFGE結果見圖1。

3 討論

根據我院常規細菌耐藥性監測數據顯示 ，兒科送檢的微生物標本占全院微生物標本的一半以上，碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌中肺炎克雷伯菌最多見，主要集中在兒科病房[10]。2014年以前我院兒科病房未檢出CRKP。2014年5月首先在NICU中10 d內3例患兒血液中相繼檢出CRKP，2015年12月在NICU前后半個月2例患兒痰培養檢出CRKP，2016年上半年NICU每月報告1例或2例患兒痰培養檢出CRKP。普兒科僅在2016年2月第1次報告，一對雙胞胎痰培養中同時檢出CRKP，同年4月報告1例患兒痰培養檢出CRKP。普兒科3例患兒均是在入院當日送檢痰培養后檢出CRKP。NICU的13例CRKP中僅有38.5%（5/13）是入院48 h內檢出，61.5%（8/13）是入院48 h以后檢出，其中8例來源于痰，4例來源于靜脈血，1例來源于氣管導管末端。

圖1 部分菌株PFGE同源性分析圖Figure 1 Pulsed-field gel elelectrophoresis patterns of 8 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates

藥敏結果顯示，與國內報道相同的是未發現對多黏菌素耐藥菌株，不同的是CRKP對環丙沙星、阿米卡星的高敏感性，對β內酰胺類及酶抑制劑復方制劑和碳青霉烯類藥物未見敏感菌株[11]。

目前，碳青霉烯類抗生素因具有抗菌譜廣、抗菌活性強的特點，是治療多重耐藥腸桿菌科細菌感染的最后一道防線。不同地區CRKP產生的碳青霉烯酶類型不同，國內外報道最多的碳青霉烯酶是KPC基因型，兒童患者產金屬酶如IMP-4基因型較多見，NDM型偶有報道[11-12]，本研究收集2014－2016年兒童患者分離的16株CRKP中，未檢出KPC酶，只檢出6株產金屬酶，其他10株CRKP菌株金屬酶檢測表型試驗陽性但基因型檢測為陰性，抽取2株菌2007和2119做接合試驗，與大腸埃希菌EC600接合成功，證明碳青霉烯酶耐藥基因位于可移動質粒或基因元件上，存在著傳播風險，但未檢測到耐藥基因，推測是否可能是某種金屬酶的變異體或新型金屬碳青霉烯酶導致細菌耐藥，今后需進一步研究。

根據PFGE的結果分析，CRKP在新生兒科的為A 型、C 型、B型，普兒科為D型；新生兒菌株1973、2007、2106、1918具有同源性，提示CRKP在NICU內有流行，要著重監控CRKP病例，需引起感染科和醫護人員的高度重視，及時采取隔離措施，防止醫院感染暴發。