雙峰駝駝乳中血清白蛋白的 分離純化及其結(jié)構(gòu)表征

郭 雁,明 亮,伊 麗,伊日貴,高婉婷,吉日木圖,2,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018; 2.內(nèi)蒙古駱駝研究院,內(nèi)蒙古阿拉善 750306)

內(nèi)蒙古優(yōu)越的氣候地貌和植物資源為我國(guó)特有種群雙峰駝提供了良好的生存環(huán)境和條件。與其他畜牧牲畜相比,雙峰駝具有極高的農(nóng)業(yè)和食品經(jīng)濟(jì)價(jià)值。雙峰駝駝乳作為荒漠、半荒漠地區(qū)的重要奶源之一,營(yíng)養(yǎng)豐富,易于消化吸收,且乳中蛋白組分具有很好的生物醫(yī)藥應(yīng)用前景[1-5]。

血清白蛋白(Serum albumin,SA)是乳中重要的蛋白組分,含量為(8.5±3.58) mg/mL,其分子量相對(duì)較大,大約為70 kDa并帶有負(fù)電荷[6-8]。SA通常由肝臟合成,在動(dòng)物體內(nèi)參與運(yùn)輸脂肪酸、類固醇激素、氨基酸以及膽色素等物質(zhì)。SA含有多個(gè)配體結(jié)構(gòu)域,能夠與代謝物、維生素、金屬離子及藥物等結(jié)合,在血液循環(huán)中可作為許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)載體。血管內(nèi)的SA在維持血漿膠體滲透壓方面也起到重要作用,可調(diào)節(jié)機(jī)體的水電平衡和酸堿平衡[9-11]。

目前對(duì)SA的研究主要集中在單峰駝[12-13]及異源動(dòng)物上[14-15],如牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)和人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA),對(duì)雙峰駝血清白蛋白(Camel serum albumin,CSA)特別是雙峰駝駝乳中CSA的研究相當(dāng)匱乏。因此本研究擬從雙峰駝駝乳中分離CSA,并對(duì)其氨基酸序列、分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成及二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,旨在綜合開發(fā)利用雙峰駝駝乳及雙峰駝駝乳蛋白,并為探究CSA與其他動(dòng)物SA的差異與優(yōu)勢(shì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

駝乳 內(nèi)蒙古阿拉善盟健康雙峰母駝6峰,分別擠奶后混合乳樣,采集后置于-80 ℃保存;預(yù)染蛋白Marker(10～170 kDa) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;SDS-PAGE預(yù)制膠(15%分離膠、5%濃縮膠) 江蘇南京金斯瑞生物科技有限公司;等點(diǎn)聚焦標(biāo)準(zhǔn)物 美國(guó)GE公司;兩性電解質(zhì) 美國(guó)Bio-Lyte;二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;異硫氰酸苯酯(PITC)、乙腈 美國(guó)Sigma公司;所有試劑 均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 駝乳預(yù)處理 駝乳在4 ℃下解凍。解凍后于4 ℃,5000 r/min,離心30 min。棄去上層脂肪,即得脫脂乳。脫脂乳在室溫下用1 mol/L的HCl溶液調(diào)至pH為4.3,40 ℃水浴20 min,8000 r/min離心20 min(4 ℃),收集上清液(乳清)[16-17]。將收集的上清液用0.22 μm針頭濾器過濾,-20 ℃保存?zhèn)溆肹6]。

1.2.2 離子交換層析分離CSA 采用DEAE-FF層析柱(16 mm×25 mm),用20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH8.4)平衡層析柱直至紫外吸收基線、電導(dǎo)穩(wěn)定[18]。將過濾后的乳清蛋白樣液加入DEAE-FF層析柱,用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.4)洗脫。待紫外(UV)值較穩(wěn)定,用含0.1～0.4 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH8.4)進(jìn)行線性洗脫[19]。洗脫速度60 mL/h,280 nm下自動(dòng)檢測(cè)并記錄。收集洗脫峰,-20 ℃保存?zhèn)溆茫珺SA標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照。

1.2.3 凝膠層析純化CSA Sephacryl S-100層析柱(16 mm×60 mm)用20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH8.4)平衡至基線穩(wěn)定。將DEAE-FF層析柱收集的洗脫液上樣進(jìn)行二次純化。洗脫速度30 mL/h,280 nm下自動(dòng)檢測(cè)并記錄,收集洗脫峰,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 CSA純度的鑒定 采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法。將層析收集所得的蛋白質(zhì)洗脫峰,用SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)所純化蛋白組分進(jìn)行鑒定[20-21]。所用分離膠濃度為15%,濃縮膠濃度為5%。起始恒定電壓為90 V,時(shí)間約為30 min。進(jìn)入分離膠后,恒定電壓120 V,時(shí)間約2 h。當(dāng)染料(溴酚藍(lán))距底邊1 cm時(shí),停止電泳。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色,脫色液脫色,將凝膠放入凝膠成像儀中成像。

1.2.5 氨基酸序列覆蓋率分析 參考Nagarj等[22]和Thakur[23]的方法,將純化后CSA經(jīng)胰酶酶解后,采用高相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)對(duì)CSA進(jìn)行氨基酸序列分析。通過質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索實(shí)現(xiàn)對(duì)CSA的鑒定。

1.2.6 CSA結(jié)構(gòu)表征

1.2.6.1 CSA分子量的測(cè)定 采用液質(zhì)聯(lián)用LC-MS高分辨質(zhì)譜對(duì)CSA的相對(duì)分子量進(jìn)行分析[24-25]。將一定量CSA加入0.1%甲酸水中,調(diào)節(jié)pH至2～3之間,離心(3000 r/min,10 min)取上清;用BCA試劑盒以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定上清中蛋白濃度,并用0.1%甲酸水稀釋樣品濃度至0.1 μg/μL進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

高效液相色譜條件:色譜柱為MAbPac RP,Analytical(0.3 mm×150 mm),采用0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)流動(dòng)體系,分析時(shí)間為20 min,流速200 μL/min,梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

質(zhì)譜條件:采用IDA采集模式,一個(gè)MS1圖譜選擇40個(gè)最強(qiáng)的母離子進(jìn)行串級(jí)掃描,質(zhì)譜掃描范圍800～4000 m/z。

1.2.6.2 CSA等電點(diǎn)的測(cè)定 參照楊宇峰等[26]的方法,采用等電聚焦電泳法測(cè)定樣品的等電點(diǎn)。將一定量CSA進(jìn)行超濾脫鹽處理,隨后選用適當(dāng)?shù)某瑸V管超濾濃縮,再以1%甘氨酸進(jìn)行置換超濾清洗。將置換后樣品和對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品至上樣孔,按照電壓500 V,電流50 mA,功率為每1 cm凝膠1 W的電泳條件,電泳20 min,之后設(shè)置電壓2000 V,電流50 mA,功率為每1 cm凝膠1 W,再電泳90 min后停止。經(jīng)染色,脫色后轉(zhuǎn)移至掃描儀進(jìn)行圖像掃描,并用Image Quant TL Version 7.0軟件分析樣品的等電點(diǎn)。

1.2.6.3 CSA氨基酸組成分析 通過異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生法測(cè)定CSA水解物中游離氨基酸以確定氨基酸組成[27]。

將CSA在6 mol/L HCl條件下水解成游離氨基酸,然后用PITC對(duì)游離氨基酸進(jìn)行衍生化處理,處理完畢后,以18種氨基酸為標(biāo)準(zhǔn)品,在同等高效液相色譜條件下，對(duì)衍生化的氨基酸樣品對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間進(jìn)行分析,并計(jì)算各氨基酸的含量。

高效液相色譜條件:流動(dòng)相A液為0.05 mol/L乙酸鈉水溶液,B液為甲醇乙腈水溶液(甲醇∶乙腈∶水=20∶60∶20(V∶V∶V)),流速1.0 mL/min,柱溫35 ℃。色譜柱以95%的A液平衡后,樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到氨基酸分析柱Diamonsi AAA(250 mm×4.6 mm)。梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.2.6.4 CSA圓二色譜分析 將純化的CSA溶液置于超濾管中,利用反復(fù)濃縮的方法使20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH8.4)替換為20 mmol/L PB緩沖液(pH8.0)。根據(jù)儀器響應(yīng)水平將蛋白質(zhì)量濃度濃縮為0.2 mg/mL,以20 mmol/L PB緩沖液(pH8.0)作為空白對(duì)照[28-29]。

圓二色譜條件:波長(zhǎng)掃描范圍為190～250 nm,步長(zhǎng)1.0 nm,掃描速度50 nm/min,檢測(cè)環(huán)境為室溫。掃描后圓二色譜圖利用Jwstda32軟件對(duì)樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行擬合計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件分析,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(S)的形式,n=3。

2 結(jié)果與分析

2.1 駝乳乳清蛋白陰離子柱層析分離

駝乳乳清蛋白的DEAE-FF離子交換層析洗脫曲線見圖1。由圖1可知,在280 nm紫外檢測(cè)儀在線檢測(cè)條件下得到5個(gè)洗脫峰,其中用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.4)洗脫得到3個(gè)洗脫峰,即峰Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ;待UV值較穩(wěn)定后,采用含有0.1～0.4 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.4)進(jìn)行線性洗脫得2個(gè)洗脫峰,即峰Ⅳ,Ⅴ。收集上述洗脫峰并通過SDS-PAGE凝膠電泳，對(duì)DEAE-FF離子交換層析所得的蛋白組分進(jìn)行分析,結(jié)果如圖2所示,以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照可知,洗脫峰Ⅴ中有目的蛋白CSA被洗脫出,該洗脫峰所對(duì)應(yīng)的NaCl濃度為0.24 mol/L左右。由于SDS-PAGE凝膠圖(圖2)中蛋白條帶Ⅴ中還存在多條雜蛋白帶,因此需對(duì)該峰的洗脫液進(jìn)行二次純化。

圖1 乳清蛋白的DEAE-FF離子交換層析圖Fig.1 DEAE-FF chromatographic fractionation of camel’s milk whey

圖2 駝乳乳清蛋白離子交換層析后 各收集峰的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoretic analysis of the purified camel whey proteins 注:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ和Ⅴ表示分別對(duì)應(yīng)圖譜中的洗脫峰Ⅰ～Ⅴ； M表示蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(15～170 kDa)。

2.2 凝膠層析純化結(jié)果與分析

對(duì)離子交換柱分離所得的含有CSA的洗脫峰Ⅴ,用聚丙烯酰胺葡聚糖Sephacryl S-100進(jìn)行進(jìn)一步純化,經(jīng)Sephacryl S-100柱層析分離純化后,其層析圖譜見3。由圖3可知,洗脫峰Ⅴ經(jīng)Sephacryl S-100純化后,獲得2個(gè)洗脫峰(Ⅰ和Ⅱ)。收集上述洗脫峰并通過SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行組分分析及純度鑒定,結(jié)果如圖4所示,Sephacryl S-100層析洗脫峰Ⅱ?qū)?yīng)的SDS-PAGE凝膠電泳蛋白條帶分子量約為70 kDa,且該蛋白條帶明顯且單一,基本無雜蛋白,因此可初步確認(rèn)該組分為目的蛋白CSA,且純化效果較好。通過蛋白凝膠圖對(duì)樣品的純度進(jìn)行分析可知,經(jīng)二次純化后目的蛋白CSA純度在95%以上,純度結(jié)果表明本試驗(yàn)所采用的方法是有效的,可行的。此外,在分離過程中緩沖液鹽濃度較低,從而避免了蛋白質(zhì)的變性降解,保證了CSA后續(xù)結(jié)構(gòu)表征的分析研究。

圖3 Sephacryl S-100凝膠層析純化圖Fig.3 Sephacryl S-100 gel chromatographic fractionation

圖4 Sephacryl S-100凝膠柱層析 收集峰的SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE electrophoretic analysis of the purified CSA.注:M表示蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(15～170 kDa), Ⅱ?qū)?yīng)Sephacryl S-100層析圖譜中洗脫峰Ⅱ。

2.3 氨基酸序列分析

LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果如圖5所示,其中黑色粗體標(biāo)記的序列為實(shí)際檢測(cè)到的肽斷。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析表明，樣品CSA的氨基酸序列與野駱駝的氨基酸序列(NCBI:XP_006188754)有較高的相似度,蛋白氨基酸覆蓋率為89%,兩者具有同源性。該結(jié)果說明純化蛋白為目標(biāo)蛋白CSA,滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

圖5 CSA/NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)XP_006188754序列覆蓋度圖 Fig.5 Database amino acid sequence of CSA(NCBI accession no. XP_006188754)was compared with the purified protein注:Carbamidomethylation表示半胱氨酸殘基的固定修飾物,Oxidation為被氧化的蛋氨酸。

2.4 CSA分子質(zhì)量的確定

通過LC-MS質(zhì)譜對(duì)提純后CSA進(jìn)行分析,可得該樣品溶液的總離子流色譜圖(圖6)及質(zhì)譜圖(圖7)。其中總離子流色譜圖僅有1個(gè)主峰,其保留時(shí)間為9.246 min;其余色譜峰由于在樣品溶液中濃度較低其峰不明顯,如:保留時(shí)間為0.542、2.983、5.318 min所對(duì)應(yīng)的色譜峰。

圖6 CSA溶液總離子流圖(TIC)Fig.6 Total ion chromatography of CSA in camel milk

圖7 CSA溶液質(zhì)譜圖Fig.7 Mass spectrum diagram of CSA solution

利用色譜圖面積歸一化法定量分析,可知CSA所對(duì)應(yīng)的色譜峰即為圖6中的主峰。因此選取保留時(shí)間在9.236 min時(shí)的質(zhì)譜圖(圖6)為研究對(duì)象,通過Bio Pharma Finder 2.0軟件將質(zhì)譜圖(圖7)中多電荷峰解卷積,得到解卷積譜圖(圖8),分析計(jì)算得CSA分子量為66490.17 Da。該分子量與之前報(bào)道的單峰駝CSA、BSA和HSA分子量基本保持一致[12,30-31]。

圖8 CSA溶液質(zhì)譜解卷積圖Fig.8 Deconvolution diagram of CSA solution

2.5 CSA等電點(diǎn)的確定

通過等電聚焦電泳法對(duì)CSA等電點(diǎn)進(jìn)行分析,CSA和等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品等電聚焦電泳圖如圖9所示。將掃描后膠圖(圖9)采用Image Quant TL Version 7.0軟件分析CSA的等電點(diǎn),計(jì)算得CSA等電點(diǎn)pI為4.48。這與已報(bào)道的BSA等電點(diǎn)4.70,HSA等電點(diǎn)4.90相近[32-33]。

圖9 駝乳中CSA等電聚焦電泳圖Fig.9 IEF of CSA in camel milk注:M-pI表示IEF等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)(4.45～9.6 kDa)。

由于蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的,因而蛋白質(zhì)分子所含的堿性氨基酸和酸性氨基酸的數(shù)目直接影響其在溶液中所帶的電荷,即影響其等電點(diǎn)[34-35]。根據(jù)上述計(jì)算結(jié)果可知CSA等電點(diǎn)偏酸性,因此CSA蛋白質(zhì)分子中含有較多酸性氨基酸。

2.6 CSA氨基酸組成分析

本文采用異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生法對(duì)CSA氨基酸組成進(jìn)行研究。樣品CSA水解后的游離氨基酸樣品經(jīng)PITC衍生化處理后,經(jīng)過高效液相色譜LC-20AT設(shè)備分析,得到的圖譜經(jīng)Labsolution軟件積分標(biāo)峰,所得的標(biāo)峰圖譜見圖10,數(shù)據(jù)處理積分結(jié)果見表3。從表3可知,CSA氨基酸除色氨酸(Trp)外,富含17種氨基酸,其中人體必需氨基酸占氨基酸總量的47.36%;氨基酸組成中含量最高的是谷氨酸(Glu),占總氨基酸含量的12.41%,其次是亮氨酸(Leu)占總量的12.3%。由于實(shí)驗(yàn)前對(duì)CSA進(jìn)行酸水解處理,天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)分別轉(zhuǎn)化為天冬氨酸(Asp)和谷氨酸,故將前者與后者理論個(gè)數(shù)合并計(jì)算;色氨酸在酸水解過程中吲哚環(huán)被破壞,因此表3中色氨酸含量無相應(yīng)數(shù)據(jù)提供。

表3 駝乳中CSA氨基酸組成含量Table 3 Amino acid composition of CSA in camel milk

圖10 駝乳中CSA氨基酸組成液相色譜圖譜Fig.10 HPLC chromatogram of amino acid composition of CSA in camel milk

參考孫軍勇[36]的報(bào)道可知，谷氨酸和天冬氨酸的流水值為零，屬于親水性氨基酸。絲氨酸疏水值為-0.3，是親水性最強(qiáng)的氨基酸。由表3可得，CSA中疏水性氨基酸含量較高，占總量的71.64%。

為了進(jìn)一步分析CSA的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,依據(jù)FAO/WHO/UNO人體必需氨基酸推薦值,從表3可以看出,CSA所含有的必需氨基酸含量均能夠滿足成人需求,而含硫氨酸(蛋氨酸(Met)和半胱氨酸(Cys)含量不能滿足兒童的需求,這可能與蛋氨酸或半胱氨酸在酸性條件下易損失相關(guān)。

2.7 CSA的圓二色譜分析

圓二色譜(CD譜)在遠(yuǎn)紫外區(qū)(185～245 nm)的掃描圖譜,反映的是蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象。計(jì)算所得的是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)比例,即α-螺旋(α-helix)、β-折疊(beta-sheet)、轉(zhuǎn)角(turn)和不規(guī)則卷曲(random coil)的比例。其中α-螺旋在192 nm附近有1個(gè)正峰,在207～210和221～222 nm處有2個(gè)負(fù)峰;β-折疊在185～200 nm附近有1個(gè)正峰,在217～218 nm附近有1個(gè)負(fù)峰;β-轉(zhuǎn)角的極值波長(zhǎng)在205 nm附近有1個(gè)正峰,在220～230 nm附近有1個(gè)弱信號(hào)負(fù)峰,在180～190 nm附近有1個(gè)強(qiáng)信號(hào)負(fù)峰;而無規(guī)卷曲在220 nm附近有1個(gè)正峰,在200 nm附近有1個(gè)負(fù)峰[37]。

CSA在遠(yuǎn)紫外區(qū)的圓二色譜圖見圖11。如圖11所示,CSA在192 nm處有1個(gè)正峰,在208,222 nm 處呈兩個(gè)負(fù)的特征肩峰,說明CSA中含有α-螺旋和β-折疊,可見CSA是一種α+β型蛋白。該分析結(jié)果與Michael Dockal報(bào)道的HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)型一致[38]。基于CD譜摩爾橢圓率(θ),采用Jwstda32軟件對(duì)樣品CSA與軟件自帶的標(biāo)準(zhǔn)二級(jí)結(jié)構(gòu)曲線進(jìn)行擬合計(jì)算,得到CSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)比例。其中α-螺旋所占比例最高為51.1%,其次是不規(guī)則卷曲19.8%和β-轉(zhuǎn)角14.8%,β-折疊含量最低8.5%。該測(cè)定結(jié)果不僅補(bǔ)充了對(duì)CSA性質(zhì)研究的空白,也為CSA的分析和鑒定提供了新的光譜鑒定依據(jù)。除此之外,有文獻(xiàn)報(bào)道BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)組成比重中α-螺旋為54.5%[39],HSA中α-螺旋含量為46.6%[40],其中CSA,BSA 所含有的α-螺旋結(jié)構(gòu)明顯高于HSA,因此CSA,BSA主鏈走向(結(jié)構(gòu))較HSA穩(wěn)定。

圖11 駝乳中CSA的CD圖譜 Fig.11 Circular dichroism spectrum of CSA in camel milk

3 結(jié)論

本研究根據(jù)雙峰駝駝乳中CSA的特性,采用離子交換層析,凝膠過濾層析分離純化CSA,并通過SDS-PAGE凝膠電泳,氨基酸序列分析對(duì)所純化蛋白質(zhì)進(jìn)行純度分析及鑒定。其中SDS-PAGE凝膠電泳經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后膠圖顯示單一條帶,經(jīng)分析得該蛋白條帶為目的蛋白CSA且其純度在95%以上,提純效果好,隨后氨基酸序列分析結(jié)果顯示,CSA氨基酸序列與野駱駝中CSA的氨基酸序列覆蓋率高達(dá)89%,兩者具有同源性,確定純化蛋白為CSA。隨后對(duì)CSA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,結(jié)果表明,CSA相對(duì)分子量為66490.17 Da,等電點(diǎn)為4.48,谷氨酸含量最高(12.41%),是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。經(jīng)過圓二色譜測(cè)定CSA二級(jí)結(jié)構(gòu),判定其符合α+β型蛋白且在一定條件下結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。