沉默HIF-1α基因逆轉結腸癌MDR的研究*

楊光磊,胡巖芳,張 叢,許書清,彭林濤,葛國慶,胡延偉,王 釗,張仕東

(邢臺市人民醫院:1.普外科；2.神經內科，河北邢臺 054031)

表1 HT-29 MCS的水平下各組目的蛋白表達的抑制情況對比

a：P<0.05，與B組對比；b：P<0.05，與D組對比；c：P<0.05，與E組對比；d：P<0.05，與C組對比

結腸癌為臨床上較為常見惡性腫瘤，化療對患者的療效有重要影響，但患者不同化療的方式間的敏感性有非常大的差異，患者的治療效果不是很理想，而患者體內腫瘤細胞的多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是其化療失敗的重要因素[1]。腫瘤細胞不僅對服用過的藥物產生耐藥性，還會對和原藥物作用機制、結構完全不一樣藥物也發生較差的耐藥性。相關研究顯示，造成惡性的腫瘤患者死亡中有近95%都是和腫瘤的耐藥有關聯。在結腸癌患者機體內，腫瘤細胞的缺氧為正常的狀況，在缺氧所導致腫瘤細胞的生物學特征變化中，缺氧的誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)在這個過程中有這重要影響。HIF-1α一般在腫瘤細胞內進行過度表達，和腫瘤患者預后也有密切聯系，在缺氧的情況下還會使腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的抵抗性加大[2-3]。本文通過探討沉默HIF-1α基因對結腸癌MDR逆轉的影響，為臨床患者的治療提供一些新的思路。

1 材料與方法

1.1材料與試劑、儀器 (1)材料：人結直腸腺癌細胞HT-29細胞(通派上海生物科技有限公司)。(2)試劑：瓊脂糖粉(美國Sigma公司)、胰酶(美國Hyclone公司)、長春新堿(VCR，浙江海正藥業股份有限公司)、胎牛血清(FBS，民海生物公司)、二甲亞砜(DMSO，美國Sigma公司)、鹽酸阿霉素(ADR，海正藥業公司)、伊立替康(CPT-11，山東羅欣藥業集團股份有限公司)、miR的重組慢病毒(美國Invitrogen公司)、5-氟尿嘧啶(5-Fu，上海旭東海普藥業有限公司)。(3)儀器：CO2的培養箱(美國Thermo Forma公司)、酶標儀(型號：Bio-RAD Model 550，美國Biol-Tiok公司)、流式的細胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

1.2方法

1.2.1培養細胞 (1)常氧的培養：使用DMEM的高糖培養基對HT-29細胞進行培養，內含100 U/mL的鏈霉素、10%的FBS和100 U/mL的青霉素，使用0.3%的胰酶進行消化傳代；(2)低氧的培養：向密封的容器內充進混合的氣體(4% CO2、96% N2)，速度為10 L/min，連續10 min；(3)使用liquid overlay的技術對HT-29細胞進行三維的培養。

1.2.2Western blot法檢查 使用Western blot法檢查HT-29 MCS內HIF-1α的miR的重組慢病毒的干擾情況[4]：將HT-29 MCS的實驗細胞分成5組，Neg-miR感染組(A組)、親本HT-29 MCS未處理(常氧)組(B組)、MDR1 miR感染組(C組)、親本HT-29 MCS未處理(低氧)組(D組)和HIF-1α miR感染組(E組)；分別進行3次實驗，取其平均值當做最終的結果。

1.2.3檢查細胞周期 檢查低氧與常氧情況下HT-29 MCS的細胞周期[5]：把未處理親本HT-29 的細胞分成低氧組與常氧組(即D組和B組)，待HT-29 MCS產生中等大小以后，加入無酶的消化液(每孔28 μL)，使MCS的細胞逐漸分散；使用PBS進行2次洗滌，使用流式的細胞儀進行檢測。

1.2.4檢查化療的敏感性[6]將MDR1或HIF-1α miR的慢病毒感染HT-29細胞和親本的HT-29細胞進行三維的培養建立HT-29 MCS，采用CPT-11、ADR、5-Fu和VCR檢測其在低氧和常氧情況下的化療的敏感性。

1.2.5各組HT-29 MCS的細胞死亡[7]使用流式的細胞檢測儀對CPT-11、ADR、5-Fu和VCR影響后各組細胞的死亡情況。

2 結 果

2.1HT-29 MCS的水平下各組目的蛋白表達的抑制情況 HT-29 MCS的水平下各組目的蛋白表達的抑制差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2HT-29 MCS的細胞周期情況 D組、E組和C組與B組對比差異均有統計學意義(P<0.05)，E組與D組對比差異有統計學意義(P<0.05)，C組與E組對比差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 HT-29 MCS的細胞周期情況對比

a：P<0.05，與B組對比；b：P<0.05，與親D組對比；c：P<0.05，與E組對比

2.3各組化療的敏感性情況 D組(VCR、ADR、5-Fu)、C組(5-Fu)、E組(5-Fu)與B組對比差異有統計學意義(P<0.05)，E組(VCR、ADR、5-Fu)、C組(ADR、VCR)與D組對比差異有統計學意義(P<0.05)，C組(5-Fu)與E組對比差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

2.4各組HT-29 MCS細胞的死亡情況 D組(VCR、ADR、5-Fu)、C組(5-Fu)、E組(5-Fu)與B組對比差異有統計學意義(P<0.05)，E組(VCR、ADR、5-Fu)、C組(ADR、VCR)與D組對比差異有統計學意義(P<0.05)，C組(5-Fu)與E組對比差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表3 不同藥物影響下各組IC50情況對比

a：P<0.05，與B組對比；b：P<0.05，與D組對比；c：P<0.05，與E組對比

表4 在藥物的作用下HT-29 MCS細胞的死亡情況對比

a：P<0.05，與B組對比；b：P<0.05，與D組對比；c：P<0.05，與E組對比

3 討 論

很多實體的瘤內的缺氧情況很常見，結腸癌患者的組織缺氧狀況更加明顯。腫瘤的細胞發生缺氧以后會產生代謝與遺傳的變化，不但使細胞本身繼續生存增殖，還會對很多化療的藥物產生耐受性，致使患者的療效降低[8-10]。HIF-1在腫瘤細胞的缺氧反應中有重要作用，這使它成為扭轉缺氧的腫瘤細胞療效的新靶點。

本文中選取CPT-11、ADR、5-Fu及VCR當作沉默靶基因和低氧處理的前后檢查化療的敏感性藥物，這幾種藥物都是臨床上比較常見的，而且他們間的耐藥影響和作用的機制各不相同。MDR1與HIF-1α的兩套miR的重組慢病毒的干擾體系可以跟隨細胞進行傳代，不但在單層的HT-29的水平上對目的基因的表達進行沉默，還能夠顯著地對靶基因蛋白的表達產生抑制作用。本文研究中對各組細胞死亡狀況，使用的Annexin V-APC/PI的檢查系統，工作機理為在一般的細胞內，磷酯酰絲氨酸(PS)在細胞膜的脂質內側有分布，但在前期細胞發生死亡時，細胞膜內PS會從內側向外側進行翻轉。Annexin V為磷脂結合的蛋白，它和PS的親和力比較強，可以與前期的細胞外側PS進行結合[11-13]。本文研究發現，低氧能夠使結腸癌患者的HT-29 MCS細胞對5-Fu、VCR和ADR發生顯著耐藥性，而且細胞的死亡率比正常情況下的要低。此后經過MDR1或者HIF-1α基因驗證了HIF-1α受到了明顯的抑制，HT-29 MCS細胞對5-Fu、VCR和ADR敏感性明顯加強，藥物的扭轉率得到提升，藥物引導下細胞的死亡率也顯著提升，說明HIF-1α miR的干擾體系結合藥物能夠使耐藥的細胞死亡，患者治療效果提高。MDR1基因也受到了明顯地抑制，HT-29 MCS細胞對VCR與ADR敏感性顯著加強，藥物的扭轉率得到提升，藥物引導下細胞的死亡率也顯著提升，但對5-Fu沒有明顯的作用[14-15]。

綜上所述，低氧能夠使結腸癌的親本HT-29 MCS出現MDR的表型，成為耐藥的模型，沉默HIF-1α能夠顯著逆轉HT-29 MCS細胞對5-Fu、VCR和ADR的耐藥性。