Ox-LDL誘導(dǎo)肝硬化患者巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ET

孟慶洋 徐春林 康鵬

越來(lái)越多的研究認(rèn)為，肝硬化的發(fā)展與免疫機(jī)制有關(guān)，這種新型的程序性死亡被稱為“ETosis”，以擠壓的方式釋放到細(xì)胞外，最終形成ET[1，2]。ET是細(xì)胞核內(nèi)的DNA和胞質(zhì)蛋白結(jié)合后釋放在胞外形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[3]。巨噬細(xì)胞釋放的ET命名為巨噬細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(macrophage extracellular traps，MET)[4]。本研究探討氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)在肝硬化患者中是否通過(guò)巨噬細(xì)胞釋放MET促肝硬化的發(fā)展。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2018年1月至2018年10月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染科門診診治的肝硬化患者50例，男25例,女25例,年齡42～68歲,平均(49.3±7.1)歲;其中乙型肝炎肝硬化25例,酒精性肝硬化11例,丙型肝炎肝硬化7例,自身免疫性肝硬化4例,血吸蟲性肝硬化2例,隱源性肝硬化1例。肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》。診斷主要依靠:①肝臟超聲和 (或)肝臟彈性超聲檢查;②病毒性肝炎史及HBV、HCV血清學(xué)標(biāo)志物;③自身免疫抗體;④飲酒史;⑤血吸蟲病史;⑥其他器官疾病等。另選50名健康體檢者作為對(duì)照，其中男25名,女25名,年齡30～66歲,平均(45.7±11.5)歲。

二、ET水平檢測(cè)

分別采集肝硬化患者及健康人外周靜脈血，檢測(cè)MPO-DNA復(fù)合物水平，其間接反映ET的水平。ELISA試劑盒檢測(cè)MPO-DNA復(fù)合物，按照說(shuō)明書加入待測(cè)樣本10 μL，稀釋液40 μL，HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，封孔，37℃溫育60 min.棄去液體，洗板。每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光溫育15 min，加入終止液50 μL，測(cè)定各孔吸光度值，按曲線方程計(jì)算濃度值。

三、ox-LDL水平檢測(cè)

采集肝硬化患者及健康人外周靜脈血，ELISA試劑盒檢測(cè)ox-LDL，按照說(shuō)明書在待測(cè)樣品孔中先加入樣品稀釋液40 μL，再加入待測(cè)樣品10 μL(樣品最終稀釋度為5倍)，將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

四、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換

1.巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)：采用Ficoll-Hypaque法分離提純外周靜脈血。按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，向培養(yǎng)板中加入含156 ng/mL的PMA的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。更換培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞貼壁情況，同時(shí)注意觀察貼壁細(xì)胞的鏡下形態(tài)。將所得巨噬細(xì)胞按照2×105個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于培養(yǎng)板上。

2.誘導(dǎo)、提取ET：將所得巨噬細(xì)胞用ox-LDL刺激5 h，隨機(jī)取部分細(xì)胞行免疫熒光染色及掃描電鏡檢查，確認(rèn)ET的形成。對(duì)剩余細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)震蕩，取上清液，按照Picogreen dsDNA試劑盒(Invitrogen)說(shuō)明書提取ET備用。

3.ET促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換：分別將獲得的M1型巨噬細(xì)胞及M2型巨噬細(xì)胞分為M1/M2+PBS、M1/M2+ET、M1/M2+樹突細(xì)胞和M1/M2+樹突細(xì)胞+ET組。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，記錄各組中M1與M2的比例。比較分析培養(yǎng)過(guò)程中M1/M2的比例變化，分析IFN-α/IFN-γ水平與巨噬細(xì)胞M1/M2的比例的相關(guān)性，以及ET是否可以影響巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。

結(jié) 果

一、ox-LDL、LPS、IL-6 刺激健康人巨噬細(xì)胞

以LPS、ox-LDL、IL-6分別刺激健康人巨噬細(xì)胞1、2、3、4、5和6 h固定染色，結(jié)果免疫熒光確定均無(wú)ET形成(圖1)。

圖1 LPS、ox-LDL、IL-6刺激健康人巨噬細(xì)胞鏡下表現(xiàn)

二、PMA刺激肝硬化患者巨噬細(xì)胞

156 ng/mL、200 ng/mLPMA刺激肝硬化患者巨噬細(xì)胞1、2、3、4、5、6 h后固定染色，免疫熒光確定ET。結(jié)果200 ng/mL刺激1 h細(xì)胞核即破碎，出現(xiàn)凋亡壞死的跡象。156 ng/mL刺激4 h左右出現(xiàn)細(xì)胞核脹大，有的細(xì)胞膜甚至破裂，細(xì)胞內(nèi)的顆粒流出(圖2)。

注：箭頭所示為細(xì)胞膜破裂顆粒流出

圖2156 ng/mL PMA刺激肝硬化患者巨噬細(xì)胞4 h的鏡下表現(xiàn)

三、巨噬細(xì)胞熒光染色結(jié)果

將培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞在 156 ng/mL PMA濃度下分別進(jìn)行2、3 、4、5 h的免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)4 h為最佳ET觀察時(shí)期。3 h可見(jiàn)巨噬細(xì)胞有“吐核”的趨勢(shì)，5 h大部分細(xì)胞已凋亡壞死僅剩部分細(xì)胞。3 h細(xì)胞膜破裂，可見(jiàn)胞內(nèi)的顆粒流出，同時(shí)DAPI染色后可見(jiàn)云絮狀的藍(lán)色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即為ET(圖3)。

四、ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞形成ET

免疫熒光染色3 h和4 h細(xì)胞的形態(tài)變化并不太明顯，第5小時(shí)細(xì)胞核才出現(xiàn)明顯的絮狀物，而PMA加ox-LDL聯(lián)合刺激巨噬細(xì)胞在第5小時(shí)已出現(xiàn)比較明顯的藍(lán)色絮狀物，可見(jiàn)ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞形成ET在第5小時(shí)最為明顯，而PMA加ox-LDL可以促進(jìn)這一進(jìn)程，在同樣的刺激時(shí)間藍(lán)色絮狀物出現(xiàn)的更多(圖4)。

注：箭頭所指藍(lán)色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為ET

圖3156 ng/mL PMA刺激肝硬化患者巨噬細(xì)胞不同時(shí)間的鏡下表現(xiàn)

五、ET誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型和M2型的轉(zhuǎn)換

采用上述方法從外周血或人單核細(xì)胞系經(jīng)PMA誘導(dǎo)形成巨噬細(xì)胞，取部分巨噬細(xì)胞即為M0分為兩組，分別鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，以IFN-γ(100 U/mL)和LPS (5 ng/mL)共同刺激培養(yǎng)24～96 h，誘導(dǎo)出M1型巨噬細(xì)胞；以IL-4 (10 ng/mL)刺激培養(yǎng)24～96 h誘導(dǎo)出M2型巨噬細(xì)胞，經(jīng)ET誘導(dǎo)后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)(圖5)。

討 論

最初有關(guān)ETosis的研究集中在殺菌和抗病毒方面，后續(xù)發(fā)現(xiàn)其在肝臟腫瘤免疫疾病方面具有重要作用[5-9]。ox-LDL是脂質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，氧化應(yīng)激反應(yīng)激活、氧自由基大量生成是造成肝硬化肝臟損傷加重的重要病理環(huán)節(jié)[10-12]。因此 ox-LDL在肝硬化發(fā)展過(guò)程中起著一定作用。研究證實(shí)，ET可能與肝硬化程度相關(guān)[13]。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)M1型、M2型巨噬細(xì)胞

本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL 通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ET，且ox-LDL水平與ET水平呈正相關(guān)，增加ox-LDL刺激時(shí)間ET的產(chǎn)生亦明顯增加，其發(fā)生機(jī)制可能與巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換有關(guān)，而巨噬細(xì)胞表型與肝硬化發(fā)展之間的關(guān)系有待于進(jìn)一步深入研究。

本研究表明，ox-LDL促進(jìn)肝硬化的發(fā)展可能與巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ET有關(guān)。期待將ET作為標(biāo)志物，為肝硬化嚴(yán)重程度的診斷、治療提供新思路。