嬰兒型糖原貯積病Ⅱ型基因型表型相關性分析和出生缺陷預防

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(1 西安交通大學附屬兒童醫院(西安市兒童醫院)心內科，陜西 西安 710003； 2 空軍軍醫大學第一附屬醫院婦產科；3 西安交通大學附屬兒童醫院(西安市兒童醫院)超聲科； 4 陜西省兒科疾病研究所； 5 西安市兒童健康與疾病重點實驗室)

糖原貯積病Ⅱ型(GSDⅡ)又稱龐貝病，發病率約為1/40 000[1]，是一種罕見的常染色體隱性遺傳病。其發病機制為位于17q25.3染色體上編碼酸性α-葡糖苷酶(GAA)的基因發生突變，使溶酶體內GAA缺乏，致糖原不能轉化為葡萄糖，從而在骨骼肌、心肌和平滑肌等組織細胞內大量沉積[2]。本研究對2016年12月—2017年5月于西安市兒童醫院心內科確診的4例伴有肥厚型心肌病的GSDⅡ病兒的臨床特點、GAA活性以及GAA基因進行分析，總結臨床表現、酶學特點和基因變異的相互關系，并對下一胎進行遺傳咨詢和產前診斷。現將結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2016年12月—2017年5月西安市兒童醫院心內科確診的GSDⅡ住院病兒4例,男3例,女1例，發病年齡為2～8月齡，確診年齡為2～9月。4例病兒均因呼吸道感染就診，有明顯的運動發育遲緩或伴語言發育落后，主要為四肢無力、肌張力低下，累及四肢、軀干肌，面肌未受累。4例呼吸肌無力，均有心肌受累；舌體肥大2例；4例伴有肝大。4例肌酸激酶(CK)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)均升高，達正常值3～10倍。4例進行了心電圖檢查，提示PR間期80～90 ms，雙心室肥厚。1例肌電圖檢查示肌源性損害。4例病兒心臟B超均示左心室增大，左心室壁彌散性增厚，左心室后壁內膜增厚，提示肥厚型心肌病。病兒分別來自4個不同家庭，父母均非近親婚配，無遺傳病家族史，因呼吸道感染、心臟超聲發現心肌肥厚就診。臨床資料包括病史、心電圖、超聲心動圖、心臟核磁共振、心肌酶、肝腎功及GAA酶活性檢查和基因檢測。本研究經西安市兒童醫院倫理委員會批準同意，病兒家長均簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1GAA酶活性測定 外周血白細胞用生理鹽水重懸，取20 μL白細胞懸液(約2 μg蛋白)加入80 μL反應體系(1 mmol/L 4-甲基傘形酮-α-D-葡萄糖苷，pH 4.3的50 mmol/L醋酸鈉緩沖液，1 g/L的Triton X-100，10 μmol/L阿卡波糖)中，37 ℃水浴反應2 h。加入pH 10.7的0.1 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液150 μL終止反應。檢測反應體系熒光(BioTek SynergyH4多功能酶標儀)激發波長360 nm，發射波長450 nm。空白對照為相同條件，反應體系中不加蛋白。配置不同濃度的4-甲基傘形酮，繪制標準曲線，按照標準曲線計算出產物濃度。蛋白濃度用Bradford法測定。

1.2.2基因組DNA的提取和GAA基因突變分析基因組DNA的提取：采集病兒及其父母外周血各2 mL，用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因組DNA，放至-80 ℃低溫冰箱保存備用。高通量測序(病兒2)：將先證者的基因組DNA送至北京信諾百世醫學檢驗所進行心血管系統疾病相關基因panel的靶向捕獲二代測序，對二代測序所分析出的候選基因突變位點在家系內進行Sanger測序驗證。Sanger測序(病兒1、3、4)：依據NCBI GAA基因 (NM_000152.3)序列，采用Primer 5.0軟件設計引物，擴增GAA基因的20個外顯子序列。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min， 95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，共進行30個循環，最后72 ℃延伸7 min。PCR擴增產物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，之后采用ABI 3500dx儀器進行雙向測序。產前基因篩查：針對家庭內有明確基因診斷的病兒母親在孕7～12周采集絨毛膜，或者于孕16周后行羊膜穿刺，抽取羊水，提取基因組DNA。按照上述Sanger測序的方法，對相應的突變位點所在的外顯子進行PCR擴增及Sanger測序，并對測序結果進行分析。

2 結 果

2.1 GAA酶活性

病兒1、2和3 GAA的活性分別為2.5、2.1和1.9 nmol/(g·min)，病兒4未行GAA活性測定。見表1。

2.2 GAA基因突變分析

4例病兒均為復合雜合突變，分別來自于病兒父親和母親(見表1)。在檢測到的8個突變中有5個錯義突變，3個插入突變，根據生物信息分析軟件SIFT、PolyPhen2及Mutation_Taster致病性分析以及美國ACMG指南[3]預測，其中7個突變為致病性突變，病兒1攜帶的p.L701P突變預測為可疑致病，結合病兒GAA活性的檢測結果，確定為致病性的突變。而在已經檢測出的突變位點中，p.L701P、p.W279C、p.N535Qfs*3突變位點在HGMD數據庫及相關文獻中均未見報道。4例病兒均攜帶復合雜合突變，符合常染色體隱性遺傳，突變測序峰圖見圖1。

2.3 治療、隨訪以及產前GAA基因突變檢測

1例病兒接受Myozyme GAA酶替代治療1個月，其余3 例病兒均未接受酶替代治療。4例病兒確診后2～6個月內均死亡，死亡原因為肺部感染、肺不張合，導致呼吸循環衰竭。2例病兒母親孕下一胎，于妊娠期行羊水穿刺胎兒GAA基因檢測，病兒3母親孕13周絨毛膜致病基因檢測確診胎兒攜帶GAA c.837G>C和c.1598-1599insC復合雜合突變，終止妊娠。病兒1母親孕18周羊水穿刺GAA檢測確定胎兒攜帶一個雜合突變，遺傳咨詢結果考慮胎兒不會發病，現已經足月娩出，出生體質量約3.4 kg，健康。

A、B、C、D分別為病兒1、2、3、4。

圖14例病兒GAA突變位點測序圖

3 討 論

GSDⅡ分為早發型 (嬰兒型)及晚發型 (青年型及成人型)。晚發型GSDⅡ多青少年起病，表現為肌力減退和呼吸肌受累等癥狀，罕見心肌受累[4]。早發型嬰兒期起病，癥狀嚴重，心肌受累的超聲心動圖表現為以左心室心肌肥厚為主的雙心室心肌向心性肥厚，多在1歲以內死于心力衰竭。由于嬰兒型早期臨床表現非特異、進展迅速、診斷治療時間窗短[5]，早期快速做出正確診斷對病兒的治療和預后有重大意義。本組報道的4例病兒發病年齡均在1歲前，伴有肥厚型心肌病和骨骼肌受累，故為早發型GSDⅡ。

GAA基因突變影響GAA的合成、磷酸化修飾、轉運以及分泌，突變性質決定殘余GAA活性，GAA活性越低，發病年齡越早，臨床表現越嚴重[6]。嬰兒型病兒皮膚成纖維細胞的GAA活性常低于正常對照的1%，而晚發型殘余酶的活性可達1%～40%[7]。國內有報道幼年起病的晚發型GSDⅡ型病兒，但無心肌肥厚表現[8]。而本組4例病兒均有明顯的心肌肥厚，心功能有不同程度的降低，血肌酸激酶升高較顯著，提示該4例病兒屬于典型的嬰兒型GSDⅡ。

GAA基因的突變型與臨床表型相關，在該組病兒1中發現的GAA基因c.1822C>T，p.R608X雜合突變為HGMD報道的已知致病性突變[9-10]；而c.2102T>C，p.L701P雜合突變既往未見報道，生物信息分析軟件SIFT、PolyPhen2及Mutation_Taster均預測該突變可能有害，病兒1臨床發病，證實了p.L701P為致病突變。病兒2攜帶的GAA基因c.1822C>T,p.R608X雜合變異，為HGMD報道的與GSDⅡ相關的已知變異，人群樣本數據篩查在個例病人中檢出上述變異[11-14]，該變異為無義變異，造成終止密碼提前出現，提示該變異可能對蛋白多肽鏈的正常合成有重要影響，該變異在外顯子組整合數據庫(ExAC)中的頻率為0.00002479，定義為致病性變異。KOBAYASHI等[15]通過將重組GAA (rGAA)對病人進行體內置換治療，發現可以減輕早期病人的癥狀。病兒2攜帶的另外一個GAA基因c.2662G>T,p.E888X雜合變異為HGMD報道的與GSD相關的已知變異[15-18]。p.E888X在ExAC中的頻率為0.00002，為致病性變異。本組病兒中有2例攜帶p.E888X，進一步證實該突變為熱點突變。病兒3 GAA外顯子4和11分別檢測到一個雜合突變位點c.837G>C，p.Trp279Cys和c.1598-1599insC，p.N535Qfs*3，這兩個位點在HGMD數據庫及相關文獻中均未見報道。 c.837G>C突變導致GAA蛋白的第279位氨基酸由色氨酸(Trp)變為半胱氨酸(Cys)，通過http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/預測其為可能致病。c.1598-1599-insC為移碼突變，導致GAA蛋白翻譯到第537位氨基酸時終止，形成一個不成熟的蛋白截短體，影響蛋白正常功能的發揮，通過http://www.mutationtaster.org/預測該位點為極有可能致病。家系驗證結果顯示，受檢者的父親和母親分別攜帶c.1598-1599insC和c.837G>C，符合遺傳共分離規律。病兒4樣本分析顯示GAA基因有2個雜合突變，即c.1802C>T，p.S601L雜合突變以及c.2662G>T，p.E888X雜合突變。這兩個位點均為HGMD報道與GSDⅡ相關的疑似致病性突變[19]。

表1 病兒GAA基因突變結果

GSDⅡ為常染色體隱性遺傳，病兒分別攜帶來自父母的致病突變方可發病，絨毛、羊水和胎兒血均可提取胎兒DNA用于產前遺傳病診斷。妊娠7～12周可以選擇絨毛膜，縮短診斷周期。妊娠14～22周可以選擇羊水穿刺，羊水取材安全性高、結果準確。如果妊娠超過22周，可以用胎兒血培養。胎兒血培養成功率高，染色體核型形態好、分裂相多[20]。本組病兒中2例母親孕下一胎，1例妊娠13周取得絨毛膜進行GAA測序后發現胎兒攜帶2個致病位點，終止妊娠。 1例在妊娠18周行羊水穿刺，GAA基因檢測確定胎兒只攜帶一個致病基因，繼續妊娠，順利分娩正常新生兒。

綜上，嬰兒發病GSDⅡ病兒分別攜帶來自父母的致病突變，病兒癥狀出現早，未經酶替代治療死亡率高。GSDⅡ在我國尚未列入產前篩查，對于病兒母親孕下一胎胎兒進行GAA基因檢查，有助于GSDⅡ出生缺陷的預防。

(感謝西安交通大學附屬兒童醫院(西安市兒童醫院)、陜西省兒科疾病研究所楊穎、張李鈺對本文基因檢測結果分析的幫助)