索拉非尼聯(lián)合小劑量阿糖胞苷治療急性髓細胞白血病療效及對患者干細胞NF-κB及FLT3蛋白表達影響

于 婷， 鄭 立,袁 穎

四川省廣元市中心醫(yī)院血液內(nèi)科(廣元 628000)

主題詞 白血病, 髓樣, 急性/治療 @索拉非尼 阿糖胞苷 @蛋白表達

急性髓細胞白血病 (Acute myeloid leukemia,AML)是髓系造血干細胞的克隆增殖導致的造血功能受損繼而出現(xiàn)白血病細胞器官浸潤、粒細胞缺乏等惡性血液腫瘤。AML在35歲以上成人中發(fā)病率最高[1]，病死率占癌癥死亡的1.6%[2],隨著腫瘤靶向治療技術(shù)的不斷提高，抑制AML異常突變基因治療研究逐漸增多，F(xiàn)LT3基因突變是AML最常見的基因突變，F(xiàn)LT3基因突變的陽性表達常預示預后不良[3]，NF-κB是一類參與炎癥、免疫、應激、腫瘤發(fā)生發(fā)展等生物學行為中基因調(diào)節(jié)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在細胞信號通路中起關(guān)鍵作用。索拉非尼是首個口服多靶點激酶抑制劑, 具有多靶點控制、廣譜、易于聯(lián)合用藥，患者耐受性好等優(yōu)點[4]，聯(lián)合化療在治療難治性和移植后復發(fā)的AML有較大的優(yōu)勢[5]。目前關(guān)于索拉菲尼聯(lián)合化療對FLT3、NF-κB表達的研究較少，此背景下，對我科62例AML患者采用索拉菲尼聯(lián)合小劑量Ara-C治療，觀察臨床療效以及對FLT3、NF-κB表達的影響，報道如下。

資料與方法

1 一般資料 選取2016年1月至2017年2月我院血液科收治的62例經(jīng)AML患者。復發(fā)難治性AML診斷依據(jù)參考中華醫(yī)學會血液學分會修訂的AML中國診療指南(2011年版)。AML患者形態(tài)學分型參考FAB分型。所有患者均經(jīng)我院細胞遺傳學、骨髓形態(tài)學、分子生物學(MICM)、免疫學等檢測[6]確診。采用隨機數(shù)字表法將患者隨機分為兩組，每組31例，研究組男16例，女15例，年齡(36.82±6.97)歲，BMI(23.58±4.25)Kg/m2，F(xiàn)AB分型：M1型7例，M2型15例， M4型4例，M5型5例，初診16例，復發(fā)15例；對照組男18例，女13例，年齡(37.26±7.05)歲，BMI(24.97±4.08)Kg/m2，F(xiàn)AB分型：M1型6例，M2型13例， M4型6例，M5型6例，初診14例，復發(fā)17例；兩組基線有可比性(P>0.05)。

2 方 法

2.1 治療方法：研究組患者于進食前1 h或進食后2 h口服索拉非尼片(德國拜耳)400 mg，2次/d，連續(xù)服用35 d，治療過程中患者若出現(xiàn)不耐受可降低服用次數(shù)至1次/d或隔日一次;阿糖胞苷注射液(國藥準字H20055128)50 mg皮下注射,治療14 d。對照組采用DA誘導化療方案：柔紅霉素(20 mg/支，國藥準字H33020925)60 mg溶于250 ml的0.9%NaCl溶液中快速靜點，1次/d,連續(xù)用藥3 d，Ara-C200 mg溶于500 ml 5%GS溶液中緩慢靜滴，連續(xù)用藥7 d。

2.2 副作用觀察及支持治療：每日5%NaHCO2250 ml靜脈滴注堿化尿液,阿扎司瓊注射液2 ml化療前后靜脈注射預防嘔吐，強水化治療(每日靜脈液體入量2500～3000 ml/m2)。中性粒細胞缺乏(ANC<0.5×109/L[7])時入住層流病室，每日皮下注射粒細胞集落刺激因子150～300 μg,無菌飲食，并加強口腔、鼻腔、外耳道、皮膚護理和肛周護理及中心靜脈置管護理。每3 d檢查一次血常規(guī)，如Hb<60 g/L，給予輸注紅細胞懸液，若Plt<20×109/L 時，給予輸注單采血小板懸液。當出現(xiàn)中性粒細胞缺乏或發(fā)熱時，給予抗感染治療，參照2012年中國中性粒細胞缺乏伴發(fā)熱患者抗菌藥物臨床應用指南[8]，抗真菌治療參考 2013 年血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標準與治療原則[9]。

2.3 NF-κB檢測方法：所有患者均于治療前后采集骨髓5 ml，置入抗凝試管，PBS液洗滌，應用免疫磁珠分選系統(tǒng)和流式細胞儀進行白血病干細胞的分選和純化。于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)骨髓單個核細胞48 h，Western Bloting法檢測NK-κB的表達。

2.4 FLT3基因檢測方法：采用多聚酶鏈反應PCR+單鏈構(gòu)象多態(tài)性SSCP方法患者治療前、后新鮮骨髓中的FLT3基因及FLT3-ITD基因突變。所有患者均于治療前、后采集骨髓5 ml，置入抗凝試管，PBS液洗滌，應用免疫磁珠分選系統(tǒng)和流式細胞儀進行白血病干細胞的分選和純化。于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)骨髓單個核細胞48 h。總DNA使用全血基因組提取試劑盒進行提取，并測定A260/A280，判斷DNA的濃度和純度。采用去離子水稀釋終樣品至500 ng/μl，備用。根據(jù)FLT3突變區(qū)的一般情況，將檢測上游引物、下游引物及擴增產(chǎn)物長度分別設計為5’-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3’、5’-CTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3’及329bp。采用PCR試劑盒，20 pmol/μl上下游引物+500 ng基因組DNA，去離子水定容至50 μl。經(jīng)過30個循環(huán)的預變性、變性、退火、延伸過程，取15 μl反應產(chǎn)物，運用瓊脂糖凝膠電泳進行結(jié)果分析。

3 觀察指標 療效評價：治療結(jié)束2周進行骨髓穿刺復查骨髓細胞形態(tài)，參照血液病學診斷及療效標準[10]，CR：未發(fā)現(xiàn)白血病細胞浸潤所致的癥狀和體征;Hb≥100 g/L(男)或Hb≥90 g/L(女及兒童)，ANC≥1.5×109g/L，血小板≥100×109g/L，外周血未發(fā)現(xiàn)白血病細胞；原粒細胞Ⅰ型 +Ⅱ型、原始細胞+幼稚單核細胞或原始淋巴細胞+幼稚淋巴細胞≤5%，紅細胞及巨核細胞系正常。PR:5%<骨髓原粒細胞Ⅰ型+Ⅱ型(原始單核+幼稚單核細胞或原始淋巴細胞+幼稚淋巴細胞)≤20%，臨床、外周血象中有一項未達完全緩解者。NR：骨髓原粒細胞Ⅰ型+Ⅱ型(原始單核+幼稚單核細胞或原始淋巴細胞+幼稚淋巴細胞)>20%，臨床癥狀未改善，外周血仍存在白血病細胞。安全性評價指標：依據(jù)WHO急性及亞急性化療藥物毒性分級標準判定不良反應，0(無)、Ⅰ(輕度)、Ⅱ(中度)、Ⅲ(重度)、Ⅳ(威脅患者生命)。

結(jié) 果

1 療效評價 研究組22例CR，7例PR，2例未緩解，對照組16例CR，9例PR，6例未緩解。兩組PR例數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；研究組CR比例高于對照組，差異具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；研究組NR比例低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2 安全性評價 研究組2例中性粒細胞缺乏，1例血小板減少、1例貧血、1例消化道不良反應、2例感染，均為Ⅰ-Ⅱ級不良反應，不良反應率22.58%，顯著低于對照組(P<0.05)，且研究組粒缺時間(12.94±2.17)d，顯著低于對照組(P<0.05)，見表2。

3 FLT3、NK-κB在不同治療組治療前后的差異 兩組FLT3、NK-κB在治療前表達無差異(P>0.05)，研究組治療后FLT3、NK-κB的表達均出現(xiàn)下調(diào)(P<0.05)，表達強度低于對照組(P<0.05)，見表3。

表1 兩組療效評價[例(%)]

表2 兩組安全性評價

表3 不同治療組治療前后FLT3、NK-κB表達的差異

討 論

FLT3是對造血免疫系統(tǒng)具有重要意義的受體絡氨酸激酶，在正常造血系統(tǒng)表達于早期造血祖細胞、樹突細胞和大腦、胎盤等組織，過度表達于AML的各個FAB分型，以及B細胞ALL和部分T細胞ALL。35%AML患者存在FLT3基因突變，F(xiàn)LT3+患者對常規(guī)化療不敏感，療效差，誘導化療緩解率低、緩解維持時間短、極易復發(fā)，部分接受異體造血干細胞移植后仍可出現(xiàn)復發(fā)，F(xiàn)LT3基因突變常提示預后不良。

索菲拉尼是一種小分子、多靶點多激酶抑制劑，對存在細胞內(nèi)和表面的Raf激酶、VEGFR-2、VEGFR-3等可顯著抑制，阻斷腫瘤新生血管的形成間接抑制腫瘤，同時索菲拉尼還可以通過抑制RAF等信號通路直接抑制腫瘤生長。索菲拉尼最初用于腎癌、肝癌的治療。本研究組患者采用索菲拉尼聯(lián)合小劑量阿糖胞苷治療AML初治和復發(fā)患者完全緩解22例，CR率70.97%，且在誘導化療期間不良反應少，雖然中性粒細胞缺乏發(fā)生率較高，但是明顯低于對照組，且中性粒細胞缺乏時間明顯短于對照組，其它不良反應均為骨髓抑制和消化道副作用，且不良反應分級均為Ⅰ-Ⅱ級，不良反應率22.58%，總體低于對照組。可能與研究組方案減少了阿糖胞苷使用劑量從而降低骨髓抑制程度有關(guān)。索菲拉尼聯(lián)合小劑量阿糖胞苷不僅可以提高臨床緩解率，而且可以降低不良反應，提高患者治療耐受度，增強治療效果。其次我們研究了不同治療方案對AML患者FLT-3以及NK-κB表達的影響，可以看出兩組治療后FLT-3、NK-κB表達均出現(xiàn)下調(diào)，證明兩種化療方案均對FLT-3、NK-κB表達都可產(chǎn)生一定的影響，但索菲拉尼聯(lián)合小劑量阿糖胞苷對FLT-3、NK-κB表達的影響程度更大，研究組方案對FLT-3基因突變AML患者治療效果優(yōu)于對照組，同時也提示我們索菲拉尼可能通過抑制FLT-3基因表達抑制白血病細胞生長增殖的機制。綜上，聯(lián)合索菲拉尼和小劑量阿糖胞苷治療可明顯降低FLT3基因的表達，提高AML臨床緩解率高，且對復發(fā)AML患者有效。