調(diào)查分析河南省肉禽和蛋禽中弓形蟲(chóng)的感染狀況

趙林靜　張振超　劉世國(guó)　張露文　王帥

【中圖分類(lèi)號(hào)】R382.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-6851（2018）07--01

1 前言

剛地弓形蟲(chóng)可以感染人類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)等動(dòng)物，是常見(jiàn)寄生蟲(chóng)。人或動(dòng)物通過(guò)攝入被弓形蟲(chóng)卵囊或者組織包囊污染的水或食物而被感染。弓形蟲(chóng)感染可以導(dǎo)致免疫力低下的禽類(lèi)死亡，造成畜禽飼養(yǎng)業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前弓形蟲(chóng)的檢測(cè)包括血清學(xué)試驗(yàn)、病理形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)、大鼠腹腔接種以及核酸檢測(cè)等方法，其中血清學(xué)試驗(yàn)的陽(yáng)性率較高但是常伴隨假陽(yáng)性[2]。使用PCR技術(shù)檢測(cè)弓形蟲(chóng)核酸具有快速并且敏感性和特異性高等優(yōu)點(diǎn)[3]，采用PCR技術(shù)分析人類(lèi)、貓和家畜中弓形蟲(chóng)感染狀況在國(guó)內(nèi)外均有應(yīng)用[4]。李永年[5]和王大偉[6]分別檢測(cè)了貴州省和遼寧省豬中弓形蟲(chóng)感染情況，同時(shí)發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)感染在家禽中也存在。但是通過(guò)PCR檢測(cè)河南省鴨、鵝和鴿弓形蟲(chóng)感染狀況尚無(wú)報(bào)導(dǎo)。從2015年2月到9月，我們采集血液樣品并使用巢式PCR對(duì)河南省家禽弓形蟲(chóng)感染狀況進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查如下。

2 材料和方法

2.1 試劑 蛋白酶K購(gòu)自德國(guó)Merck生物科技公司，Tris飽和酚和PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物公司，弓形蟲(chóng)RH株保存在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，其余試劑均購(gòu)自國(guó)內(nèi)。

2.2 樣品采集和處理 2015年2月至9月期間，隨機(jī)從鄭州、周口、新鄉(xiāng)和開(kāi)封的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、家禽飼養(yǎng)場(chǎng)和公園采集1152份血液樣品。所有樣品均置于?80 °C超低溫冰箱保存。

2.3 提取樣品DNA 使用酚試劑提取樣品DNA和弓形蟲(chóng)RH株。

2.4 巢式PCR擴(kuò)增 家禽血樣中基因組DNA作為模板，采用單管一步法巢式PCR對(duì)弓形蟲(chóng)529重復(fù)片段進(jìn)行擴(kuò)增。外套引物序列為：F：5'-CGC TGC AGG GAG GAA GAC GAA AGTTG-3'，R：5'-CGC TGC AGA CAC AGT GCA TCT GGA TT-3'；內(nèi)套引物序列為：F：5'-AGA AGG GAC AGA AGT CGA AG-3'，R：5'-CTC CAC TCT TCA ATT CTC TCC-3'。引物由上海生工生物科技公司合成，PCR反應(yīng)條件為：95℃2min； 95℃30s，68℃30s，72℃50s； 95℃30s，58℃30s，72℃50s，72℃5min，共35個(gè)循環(huán)，用10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳分析。采用弓形蟲(chóng)RH株速殖子DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，正常血樣DNA作為陰性對(duì)照，ddH2O作為空白對(duì)照。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均通過(guò)SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，使用檢驗(yàn)比較不同家禽間血樣中弓形蟲(chóng)感染的陽(yáng)性率，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 弓形蟲(chóng)529多拷貝片段擴(kuò)增結(jié)果 經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴(kuò)增的目標(biāo)條帶是弓形蟲(chóng)529片段，RH株弓形蟲(chóng)在260bp處可見(jiàn)目的條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未顯示目標(biāo)條帶。具體見(jiàn)圖1。

圖1 弓形蟲(chóng)529多拷貝片段擴(kuò)增結(jié)果

M： DNA marker； A：正常大鼠 DNA； B： RH陽(yáng)性； 98–120：雞樣品DNA； 121：空白對(duì)照.

3.2 河南不同家禽中弓形蟲(chóng)感染陽(yáng)性率 在雞、鴨、鵝和鴿總計(jì)1152份樣本中，175份檢測(cè)出弓形蟲(chóng)陽(yáng)性，陽(yáng)性率15.19%，不同種類(lèi)家禽感染率不同（=25.68），差異性顯著（P<0.05）。鵝的弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率最高（24.31%），鴿的弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率最低（5.39%）。

3.3 不同飼養(yǎng)方法的家禽中弓形蟲(chóng)感染陽(yáng)性率

3.3.1 不同條件下各種家禽中弓形蟲(chóng)感染陽(yáng)性率 和其它家禽相比，鵝的弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率很高，其中散養(yǎng)鵝的陽(yáng)性率最高（25.00%），其次為散養(yǎng)雞；鴿的感染率較低，其中信鴿的陽(yáng)性率最低（3.61%）。組間差異顯著（P<0.05），分析顯示散養(yǎng)雞和籠養(yǎng)雞以及蛋鴨和肉鴨之間感染率差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ?=12.65，χ?=11.22）

3.3.2 散養(yǎng)和籠養(yǎng)下蛋禽和肉禽中弓形蟲(chóng)感染的陽(yáng)性率 散養(yǎng)和籠養(yǎng)組間以及蛋禽和肉禽組間弓形蟲(chóng)感染的陽(yáng)性率差異性顯著（χ?=7.58，χ?= 34.81，P<0.05），蛋禽弓形蟲(chóng)感染率高于肉禽，散養(yǎng)高于籠養(yǎng)。散養(yǎng)蛋禽和籠養(yǎng)蛋禽以及散養(yǎng)肉禽和籠養(yǎng)肉禽之間弓形蟲(chóng)感染陽(yáng)性率也有差異（χ?=14.71，χ?=16.10，P<0.05），散養(yǎng)蛋禽和散養(yǎng)肉禽的陽(yáng)性率分別均高于籠養(yǎng)蛋禽和籠養(yǎng)肉禽。

3.3.3 不同地區(qū)中家禽弓形蟲(chóng)感染的陽(yáng)性率 陽(yáng)性率最高的是周口地區(qū)的鵝（30.56%），最低是周口地區(qū)的鴿（1.69%），不同地區(qū)中家禽弓形蟲(chóng)感染陽(yáng)性率不同。

4 討論

弓形蟲(chóng)是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會(huì)性致病性原蟲(chóng)，可寄生于魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行動(dòng)物和哺乳動(dòng)物引起無(wú)特異性的各種臨床表現(xiàn)，其裂殖子和速殖子包囊均有感染性。感染后可引起周?chē)鷦?dòng)物感染導(dǎo)致疾病甚至引起死亡。文獻(xiàn)表明[7]PCR技術(shù)比其它方法更適合弓形蟲(chóng)感染的流行病學(xué)調(diào)查。本研究結(jié)果提示河南省家禽中弓形蟲(chóng)感染比較常見(jiàn)，不同家禽中弓形蟲(chóng)的感染狀況不同，陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。家禽中鵝感染率最高，鴿感染率最低。原因可能是鵝的生長(zhǎng)繁殖周期長(zhǎng)而感染的概率增加；而鴿常為籠養(yǎng)接觸傳染源的概率低。結(jié)果還提示家禽弓形蟲(chóng)感染率和飼養(yǎng)方式有關(guān)，散養(yǎng)家禽感染率明顯高于籠養(yǎng)家禽。室外散養(yǎng)雞容易接觸到散布在飼料、水和土壤中的弓形蟲(chóng)卵囊，因此散養(yǎng)雞感染率也可以被作為是土壤被弓形蟲(chóng)卵囊污染的指標(biāo)[8]。相反籠養(yǎng)家禽的生長(zhǎng)環(huán)境封閉，衛(wèi)生和管理?xiàng)l件較好，切斷了弓形蟲(chóng)的傳播途徑而感染率較低。

本研究顯示不同城市中弓形蟲(chóng)感染陽(yáng)性率的差異是顯著的，提示家禽飼養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)預(yù)防寄生蟲(chóng)感染。食用半熟的雞肉和鴨肉增加了人類(lèi)弓形蟲(chóng)感染率[9]。因此在食用肉類(lèi)前應(yīng)徹底加熱以減少弓形蟲(chóng)感染。由于卵囊的抵抗力較強(qiáng)[10]，店主應(yīng)應(yīng)定期消毒禽舍并對(duì)傳染源采取預(yù)防措施，如減少老鼠、蒼蠅、蟑螂和蚯蚓[11]。如今公共食品衛(wèi)生安全廣受重視，家禽的弓形蟲(chóng)感染問(wèn)題也應(yīng)引起關(guān)注。

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