調(diào)查分析河南省肉禽和蛋禽中弓形蟲的感染狀況

趙林靜　張振超　劉世國　張露文　王帥

【中圖分類號】R382.5 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2018）07--01

1 前言

剛地弓形蟲可以感染人類和鳥類等動物，是常見寄生蟲。人或動物通過攝入被弓形蟲卵囊或者組織包囊污染的水或食物而被感染。弓形蟲感染可以導致免疫力低下的禽類死亡，造成畜禽飼養(yǎng)業(yè)的經(jīng)濟損失[1]。目前弓形蟲的檢測包括血清學試驗、病理形態(tài)學檢驗、大鼠腹腔接種以及核酸檢測等方法，其中血清學試驗的陽性率較高但是常伴隨假陽性[2]。使用PCR技術(shù)檢測弓形蟲核酸具有快速并且敏感性和特異性高等優(yōu)點[3]，采用PCR技術(shù)分析人類、貓和家畜中弓形蟲感染狀況在國內(nèi)外均有應(yīng)用[4]。李永年[5]和王大偉[6]分別檢測了貴州省和遼寧省豬中弓形蟲感染情況，同時發(fā)現(xiàn)弓形蟲感染在家禽中也存在。但是通過PCR檢測河南省鴨、鵝和鴿弓形蟲感染狀況尚無報導。從2015年2月到9月，我們采集血液樣品并使用巢式PCR對河南省家禽弓形蟲感染狀況進行了流行病學調(diào)查如下。

2 材料和方法

2.1 試劑 蛋白酶K購自德國Merck生物科技公司，Tris飽和酚和PCR擴增試劑購自北京康為世紀生物公司，弓形蟲RH株保存在新鄉(xiāng)醫(yī)學院寄生蟲學教研室，其余試劑均購自國內(nèi)。

2.2 樣品采集和處理 2015年2月至9月期間，隨機從鄭州、周口、新鄉(xiāng)和開封的農(nóng)貿(mào)市場、家禽飼養(yǎng)場和公園采集1152份血液樣品。所有樣品均置于?80 °C超低溫冰箱保存。

2.3 提取樣品DNA 使用酚試劑提取樣品DNA和弓形蟲RH株。

2.4 巢式PCR擴增 家禽血樣中基因組DNA作為模板，采用單管一步法巢式PCR對弓形蟲529重復片段進行擴增。外套引物序列為：F：5'-CGC TGC AGG GAG GAA GAC GAA AGTTG-3'，R：5'-CGC TGC AGA CAC AGT GCA TCT GGA TT-3'；內(nèi)套引物序列為：F：5'-AGA AGG GAC AGA AGT CGA AG-3'，R：5'-CTC CAC TCT TCA ATT CTC TCC-3'。引物由上海生工生物科技公司合成，PCR反應(yīng)條件為：95℃2min； 95℃30s，68℃30s，72℃50s； 95℃30s，58℃30s，72℃50s，72℃5min，共35個循環(huán)，用10 μl擴增產(chǎn)物進行核酸凝膠電泳分析。采用弓形蟲RH株速殖子DNA作為陽性對照，正常血樣DNA作為陰性對照，ddH2O作為空白對照。

2.5 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)均通過SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，使用檢驗比較不同家禽間血樣中弓形蟲感染的陽性率，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 弓形蟲529多拷貝片段擴增結(jié)果 經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴增的目標條帶是弓形蟲529片段，RH株弓形蟲在260bp處可見目的條帶，陰性對照和空白對照均未顯示目標條帶。具體見圖1。

圖1 弓形蟲529多拷貝片段擴增結(jié)果

M： DNA marker； A：正常大鼠 DNA； B： RH陽性； 98–120：雞樣品DNA； 121：空白對照.

3.2 河南不同家禽中弓形蟲感染陽性率 在雞、鴨、鵝和鴿總計1152份樣本中，175份檢測出弓形蟲陽性，陽性率15.19%，不同種類家禽感染率不同（=25.68），差異性顯著（P<0.05）。鵝的弓形蟲陽性率最高（24.31%），鴿的弓形蟲陽性率最低（5.39%）。

3.3 不同飼養(yǎng)方法的家禽中弓形蟲感染陽性率

3.3.1 不同條件下各種家禽中弓形蟲感染陽性率 和其它家禽相比，鵝的弓形蟲陽性率很高，其中散養(yǎng)鵝的陽性率最高（25.00%），其次為散養(yǎng)雞；鴿的感染率較低，其中信鴿的陽性率最低（3.61%）。組間差異顯著（P<0.05），分析顯示散養(yǎng)雞和籠養(yǎng)雞以及蛋鴨和肉鴨之間感染率差別具有統(tǒng)計學意義（χ?=12.65，χ?=11.22）

3.3.2 散養(yǎng)和籠養(yǎng)下蛋禽和肉禽中弓形蟲感染的陽性率 散養(yǎng)和籠養(yǎng)組間以及蛋禽和肉禽組間弓形蟲感染的陽性率差異性顯著（χ?=7.58，χ?= 34.81，P<0.05），蛋禽弓形蟲感染率高于肉禽，散養(yǎng)高于籠養(yǎng)。散養(yǎng)蛋禽和籠養(yǎng)蛋禽以及散養(yǎng)肉禽和籠養(yǎng)肉禽之間弓形蟲感染陽性率也有差異（χ?=14.71，χ?=16.10，P<0.05），散養(yǎng)蛋禽和散養(yǎng)肉禽的陽性率分別均高于籠養(yǎng)蛋禽和籠養(yǎng)肉禽。

3.3.3 不同地區(qū)中家禽弓形蟲感染的陽性率 陽性率最高的是周口地區(qū)的鵝（30.56%），最低是周口地區(qū)的鴿（1.69%），不同地區(qū)中家禽弓形蟲感染陽性率不同。

4 討論

弓形蟲是一種專性細胞內(nèi)寄生的機會性致病性原蟲，可寄生于魚類、鳥類、爬行動物和哺乳動物引起無特異性的各種臨床表現(xiàn)，其裂殖子和速殖子包囊均有感染性。感染后可引起周圍動物感染導致疾病甚至引起死亡。文獻表明[7]PCR技術(shù)比其它方法更適合弓形蟲感染的流行病學調(diào)查。本研究結(jié)果提示河南省家禽中弓形蟲感染比較常見，不同家禽中弓形蟲的感染狀況不同，陽性率差異有統(tǒng)計學意義。家禽中鵝感染率最高，鴿感染率最低。原因可能是鵝的生長繁殖周期長而感染的概率增加；而鴿常為籠養(yǎng)接觸傳染源的概率低。結(jié)果還提示家禽弓形蟲感染率和飼養(yǎng)方式有關(guān)，散養(yǎng)家禽感染率明顯高于籠養(yǎng)家禽。室外散養(yǎng)雞容易接觸到散布在飼料、水和土壤中的弓形蟲卵囊，因此散養(yǎng)雞感染率也可以被作為是土壤被弓形蟲卵囊污染的指標[8]。相反籠養(yǎng)家禽的生長環(huán)境封閉，衛(wèi)生和管理條件較好，切斷了弓形蟲的傳播途徑而感染率較低。

本研究顯示不同城市中弓形蟲感染陽性率的差異是顯著的，提示家禽飼養(yǎng)過程中應(yīng)預(yù)防寄生蟲感染。食用半熟的雞肉和鴨肉增加了人類弓形蟲感染率[9]。因此在食用肉類前應(yīng)徹底加熱以減少弓形蟲感染。由于卵囊的抵抗力較強[10]，店主應(yīng)應(yīng)定期消毒禽舍并對傳染源采取預(yù)防措施，如減少老鼠、蒼蠅、蟑螂和蚯蚓[11]。如今公共食品衛(wèi)生安全廣受重視，家禽的弓形蟲感染問題也應(yīng)引起關(guān)注。

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