氧化應激對精子損傷的機制及防護

李甜甜 張星穎 李連芹

[摘要] 隨著人們工作節奏加快、生活方式改變以及環境污染等因素的影響，不孕不育的發病率呈逐年上升趨勢。男性不育的主要原因為精液異常，表現為弱精、少精、無精、畸精癥等。男性精子異常的發病機制之一，是上述因素通過抑制機體抗氧化蛋白的活性或者增加活性氧自由基的水平產生氧化應激狀態，進而對精子細胞的DNA、脂質、線粒體等產生氧化損傷。對于男性精子異常，除了服用維生素E、維生素C和中草藥以外，通過戒除不良嗜好，加上適當的體育鍛煉，有助于增強自身的抗氧化能力，改善精子質量。

[關鍵詞] 男性不育癥；精子；活性氧自由基；氧化應激

[中圖分類號] R321.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（b）-0028-04

[Abstract] The occurrence of infertility is increasing with the rapid mode of work， change of life style and environmental pollution. The main cause of male infertility is abnormal sperms including asthenospermia， oligospermia， azoospermia and sperm malformation. One of the mechanisms that causes abnormal sperms is the increasing of reactive oxygen species level， which results in the oxidative damage on the DNA， lipid and mitochondria of sperms. In addition to the supplement of vitamin E， vitamin C and Chinese herbal medicine， good life habits and proper physical exercises will help to enhance self antionxidant capacity and improve the quality of sperms.

[Key words] Male infertility； Sperm； Reactive oxygen species； Oxidative stress

細胞活動所需要的能源由線粒體提供，而線粒體在提供能源的同時，會產生類似于廢氣的活性氧簇或稱活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）。同時，在生物漫長的“演變”過程中，生物體內已經形成了多種抗氧化系統，以清除多余的ROS。正常情況下，自由基的產生與清除保持平衡，使得ROS維持在低劑量狀態，作為一種信號分子，參與細胞的增殖、分化、凋亡等生理活動[1]。當機體出現病理狀態時，例如在炎癥和惡性腫瘤中，所產生的ROS水平超出了抗氧化系統的清除能力，或者當機體的抗氧化能力相對不足時，氧化和抗氧化之間的平衡被打破，就會形成所謂的“氧化應激狀態”（oxidative stress，OS）。OS通過影響細胞的信號傳導、線粒體的狀態穩定等，參與一系列生理病理過程[2]。本文對OS影響精子質量的作用機制及其防護予以綜述。

1 OS對精子的損傷機制

精液中的ROS來源于精子、生精細胞和白細胞，其中未成熟精子細胞質滯留所產生的ROS最高[3]。白細胞是精液中ROS的重要來源，其中白細胞異常增高可引起精子細胞的氧化損傷，導致精液的質量下降[4]。前列腺和精囊是精液中白細胞的主要來源，當炎癥和感染等各種刺激應答激活白細胞，引起“白細胞反應爆發”時，與正常白細胞相比，能產生高達100倍的ROS[5]。

1.1 ROS對精子細胞膜的損傷

精子膜的功能與其結構密切相關，其質膜富含高濃度的不飽和脂肪酸和雙鍵結構，這些雙鍵是維持精子膜流動性所必需的。精子膜對ROS非常敏感，質膜上的不飽和脂肪酸易受到ROS的攻擊，發生脂類過氧化反應，經過脂肪酸的活化、脂酰輔酶A的轉移、脂酰輔酶A的氧化以及三羧酸循環等過程，使脂肪酸脫羧基失去雙鍵，進而使精子膜失去流動性，從而影響受精過程中的精卵識別、膜融合、精子與頂體的融合、精子去能等一系列過程，最終導致男性精子功能障礙和男性不育。其中，丙二醛（malonaldehyde，MDA）是不飽和脂肪酸的代謝產物之一，其生成量可反映精子膜的脂類過氧化程度[6-7]

1.2 ROS對精子活動能力等指標的影響

有研究者通過檢測男性不育患者的精液參數，得出結論認為：精液氧化應激指數與精子濃度、精子總數、MDA含量、精子DNA碎片化指數成呈相關；與精子活率、前向運動率、低滲腫脹率、快速直線運動濃度、快速直線運動總數、直線速度、路徑速度、總抗氧化能力和正常形態率呈負相關[9]。另外，精液的OS可以造成精子膜功能、動態、形態參數的改變以及精子核DNA的損傷，可能是精液OS引起男性不育的重要機制之一[8]。

1.3 ROS對精子DNA的損傷

在精子的發生過程中，生精細胞核中組蛋白逐漸被魚精蛋白代替。DNA環繞在組蛋白構成的八聚體周圍，形成核小體，而魚精蛋白在DNA的螺旋溝中結合DNA，完全中和DNA，使DNA相鄰的兩條鏈通過范得華力結合在一起，從而使精子染色質緊密結合，避免ROS的攻擊。然而，在男性不育患者中，ROS與線粒體中DNA堿基反應破壞DNA的完整性，其單鏈或雙鏈斷裂，DNA片段化產生，造成遺傳信息改變或缺失。ROS還可通過脂質過氧化作用引起超氧化物歧化酶（superoxide dismutases，SOD）基因表達變化，從而影響DNA合成，升高核DNA碎片化指數[9]。以上這些ROS的損害作用，均會使男性的精液質量下降，進而造成男性不育的發病率上升。在臨床中我們發現，精子染色質異常的患者，其胚胎著床失敗率、胚胎流產率和后代發病率均高于染色質正常的患者。有研究認為，大量ROS直接攻擊DNA中的鳥嘌呤，或者羥基自由基攻擊DNA中脫氧鳥苷上的C-8位形成8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG）。目前8-OHdG已成為檢測DNA氧化損傷中最常用的生物標志物[10-11]。

1.4 ROS對精子細胞線粒體的損傷

線粒體是為精子細胞提供能量的場所，其通過糖酵解和氧化磷酸化產生“ATP”為精子細胞的活動供應能量。線粒體的結構和功能受到破壞，就會直接影響精子細胞的活力。高水平的ROS可損害線粒體膜，影響電子傳遞鏈的功能，引起細胞色素C釋放，抑制能量合成，觸發細胞凋亡[12]。目前認為，ROS對精子線粒體的損傷機制主要表現在以下方面：①使線粒體膜脂質過氧化，損傷線粒體內膜，影響呼吸鏈正常傳遞電子的過程，進而影響ATP的合成[13]。②降低線粒體內與生成ATP有關的酶活性，影響ATP產生[14]。③使線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）發生損傷。mtDNA是線粒體膜的電子傳遞鏈上必不可少的一種遺傳物質，密切參與線粒體的氧化磷酸化和ATP的生成，因此，mtDNA缺陷將導致線粒體膜電位下降，從而使氧化還原平衡更趨向于OS，最終對精子造成不可逆的傷害[14]。④誘導線粒體內Ca2+釋放，降低膜電位，增加內膜通透性，抑制ATP合成，促進細胞的凋亡[15]。精子能量的來源受到損害，精子的活力指數自然也就下降。

2 OS的防護研究

2.1 人體自身的抗氧化物質

保護精子DNA的重要因素是體內抗氧化系統和各種抗氧化劑。總抗氧化能力是指這些酶類和非酶類抗氧化物的總體抗氧化水平，其中SOD、過氧化氫酶（catalase，CAT）等是精漿中含有的可以抵抗這類ROS的重要抗氧化物質[16]。有研究表明，吸煙會導致SOD、谷胱甘肽的活性降低[17]，而適當的體育鍛煉可以提高SOD、CAT以及總抗氧化能力的水平[18]，提高抗氧化能力。

2.2 維生素E（vitamin E，VE）

豐富的VE存在于所有的谷類植物中，特別是在種子的胚芽中。VE能清除ROS，是人體最豐富的脂溶性抗氧化劑。VE不僅能促進性激素分泌，而且還參與機體的抗氧化反應，增加男子精子數量和活力。其主要通過限制超氧化物的生成及降低超氧化物水平而發揮抗氧化作用，在細胞抗氧化機制中發揮關鍵作用。在Tang等[19-20]從VE對苯丙芘誘導雄性大鼠的生殖毒性的保護作用及其機制中得出結論：隨著VE劑量增加，精子計數增加，精子畸形率逐漸降低，提示VE對苯丙芘所致生殖毒性有一定的保護作用，幾乎可以完全拮抗苯丙芘所產生的慢性生殖毒性作用[21]。

2.3 維生素C（vitamin C，VC）

在低溫冷凍時，精子經歷了離心、去除精漿、降溫冷凍、解凍復溫等一系列過程，這些物理和化學效應可致ROS增加，抗氧化物減少，抗氧化酶活性降低[22-23]。而在精液冷凍保護劑中添加一定濃度的抗壞血酸鹽、CAT，可以減少冷凍產生的過量ROS，從而減輕后者對精子核DNA的氧化損傷，提高凍融的精子質量[24-25]。Tasdemir等[26]選取30份健康可生育男性精液，并且添加改良后的人精子冷凍保護液。結果發現，含有抗壞血酸鹽的保護液其凍融后的a+b級精子與ROS水平存在負相關性，提示抗氧化劑的保護作用可能是通過減少精液凍融過程中產生的ROS而實現的。

2.4 中藥抗氧化劑的作用

我們所熟知的一些植物性中藥，如菟絲子、黃芪、葛根、人參、柴胡、金銀花、川穹、枸杞、車前草等，在動物實驗階段證實對雄性動物的生精有一定的保護作用。這些中藥各含有不同的抗氧化劑成分，包括黃酮類化合物、酚酸類化合物、皂苷類化合物、多糖、苯乙醇苷等。黃酮類化合物的抗氧化作用機制主要包括3個方面[27]：①與誘導氧化的過渡金屬離子絡合；②作用于與ROS有關的酶；③與超氧陰離子反應，阻斷ROS引發的連鎖反應。酚酸類化合物抗氧化能力的強弱與其結構上的酚羥基有關，當傳遞出氫原子后自身成為相對穩定的苯氧自由基，從而終止ROS引起的鏈式反應，通過清除ROS的作用，達到抗氧化作用。通過提高體內SOD、CAT等抗氧化酶的活性，皂苷類化合物能夠增強機體抗氧化系統功能。多糖可破壞由ROS產生的DNA分子，抑制脂質氧化，清除ROS。除了能夠清除ROS，苯乙醇苷類化合物還能夠修復已損傷的DNA。

綜上所述，過量的ROS與抗氧化系統損傷均會導致OS，其導致的精子功能障礙的機制是復雜且多方面的。ROS介導的精子質膜過氧化損傷，會導致男性生殖功能的病理性改變。過量的ROS會破壞精子核內DNA的完整性，影響受精率。高濃度的ROS破壞精子線粒體的結構和功能，會加速生殖細胞的凋亡過程，降低精液質量。抗氧化劑主要消除或減弱ROS對精子的刺激，通過阻止自由基鏈的生成，減少OS造成的損傷。面對當前男性不育所帶來的問題，ROS的過量產生所導致的精子氧化應激損傷已受到人們的關注，研究氧化損傷的來源與機制及防護是解決該問題的關鍵。

[參考文獻]

[1] Kuksal N，Chalker J，Mailloux RJ. Progress in understanding the molecular oxygen paradox-function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling [J]. Biol Chem，2017，398（11）：1209-1227.

[2] Mao X，Gu C，Chen D，et al. Oxidative stress-induced diseases and tea polyphenols [J]. Oncotarget，2017，8（46）：81649-81661.

[3] Ollero M，Gil-Guzman E，Lopez MC，et al. Characterization of subsets of human spermatozoa at different stages of maturation：implications in the diagnosis and treatment of male infertility [J]. Hum Reprod，2001，16（9）：1912-1921.

[4] 張俏忻，肖穎秀，程碧珍.白細胞異常增加對精液質量及氧化應激的影響[J].國際檢驗醫學雜志，2016，37（6）：826-727，730.

[5] Dorostghoal M，Kazeminejad SR，Shahbazian N，et al. Oxidative stress status and sperm DNA fragmentation in fertile and infertile men [J]. Andrologia，2017，49（10）：12762.

[6] Moazamian R，Polhemus A，Connaughton H. Oxidative stress and human spermatozoa：diagnostic and functional significance of aldehydes generated as a result of lipid peroxidation [J]. Mol Hum Reprod，2015，21（6）：502-515.

[7] Fraczek M，Hryhorowicz M，Gill K，et al. The effect of bacteriospermia and leukocytospermia on conventional and nonconventional semen parameters in healthy young normozoospermic males [J]. J Reprod Immunol，2016，118：18-27.

[8] Ni K，Steger K，Yang H，et al. A comprehensive investigation of sperm DNA damage and oxidative stress injury in infertile patients with subclinical，normozoospermic，and astheno/oligozoospermic clinical varicocoele [J]. Andrology，2016，4（5）：816-824.

[9] Li J，Barranco I，Tvarijonaviciute A，et al. Seminal plasma antioxidants are directly involved in boar sperm cryotolerance [J]. Theriogenology，2018，107：27-35.

[10] Muratori M，Tamburrino L，Marchiani S，et al. Investigation on the origin of sperm DNA fragmentation：role of apoptosis，immaturity and oxidative stress [J]. Mol Med，2015，21（1）：109-122.

[11] Taken K，Alp HH，Eryilmaz R，et al. Oxidative DNA damage to sperm cells and peripheral blood leukocytes in infertile men [J]. Med Sci Monit，2016，22：4289-4296.

[12] Kaur S，Saluja M，Bansal MP. Bisphenol A induced oxidative stress and apoptosis in mice testes：Modulation by selenium [J]. Andrologia，2017.Doi：10.1111/and.12834.

[13] O'Flaherty C，Matsushita-Fournier D. Reactive oxygen species and protein modifications in spermatozoa [J]. Biol Reprod，2017，97（4）：577-585.

[14] Treulen F，Uribe P，Boguen R，et al. Mitochondrial permeability transition increases reactive oxygen species production and induces DNA fragmentation in human spermatozoa [J]. Hum Reprod，2015，30（4）：767-776.

[15] Amaral A，Loureno B，Marques M，et al. Mitochondria functionality and sperm quality [J]. Reproduction，2013， 46（5）：R163-174.

[16] Dorostghoal M，Kazeminejad SR，Shahbazian N，et al. Oxidative stress status and sperm DNA fragmentation in fertile and infertile men [J]. Andrologia，2017，49（10）：e12762.

[17] Aprioku JS，Ugwu TC. Comparative evaluation of the impact of subacute exposure of smokeless tobacco and tobacco smoke on rat testis [J]. Int J Reprod Med，2015， 2015（1）：676 245.

[18] 蔡文偉，江楠.男性不育患者精液活性氧與精子參數的關系研究[J].預防醫學2017，29（3）：264-265，268.

[19] Tang Z，Ding W，Wang L，et al. Protective effect of vitamin E on methyl methanesulfonate-induced teratozoospermia in adult Sprague-Dawley rats [J]. Mol Med Rep，2015，12（3）：4422-4426.

[20] Rezaie AH，Razi M，Amniattalab A，et al. Co-administration of vitamin E and testosterone attenuates the atrazine-induced toxic effects on sperm quality and testes in rats [J]. Cell J，2017，19（2）：292-305.

[21] Adami LNG，Belardin LB，Lima BT，et al. Effect of in vitro vitamin E（alpha-tocopherol）supplementation in human spermatozoon submitted to oxidative stress [J]. Andrologia，2018.Doi：10.1111/and.12959.

[22] Balasuriya A，Serhal P，Doshi A，et al. Processes involved in assisted reproduction technologies significantly increase sperm DNA fragmentation and phosphatidylserine translocation [J]. Andrologia，2014，46（2）：86-97.

[23] Mostek A，Dietrich MA，Sowinska M，et al. Cryopreservation of bull semen is associated with carbonylation of sperm proteins [J]. Theriogenology，2017，92：95-102.

[24] Soleimanzadeh A，Saberivand A. Effect of curcumin on rat sperm morphology after the freeze-thawing process [J]. Vet Res Forum，2013，4（3）：185-189.

[25] Fontoura P，Mello MD，Gallo-Sa P，et al. Leptin improves sperm cryopreservation via antioxidant defense [J]. J Reprod Infertil，2017，18（1）：172-178.

[26] Tasdemir U，Buyukleblebici S，Tuncer PB，et al. Effects of various cryoprotectants on bull sperm quality，DNA integrity and oxidative stress parameters [J]. Cryobiology，2013，66（1）：38-42.

[27] 畢明帥，李俊君，陳帝昂，等.抗氧化類中藥對睪丸生精功能的影響研究進展[J].中國男科學雜志，2015，29（8）：59-61.