馬尾松根際溶磷菌的篩選及鑒定

宋賢沖，唐健

(廣西壯族自治區林業科學研究院，廣西 南寧 530002；廣西優良用材林資源培育重點實驗室，廣西 南寧 530002；國家林業局中南速生材繁育實驗室，廣西 南寧 530002)

金輝，吳雪

(廣西壯族自治區產品質量檢驗研究院, 廣西 南寧 530007)

鄧小軍,覃其云,石媛媛

(廣西壯族自治區林業科學研究院，廣西 南寧 530002；廣西優良用材林資源培育重點實驗室，廣西 南寧 530002；國家林業局中南速生材繁育實驗室，廣西 南寧 530002)

磷是林木生長必不可少的大量元素之一，然而在我國南方尤其是廣西，由于土壤中的固定作用強烈，導致土壤中有效磷缺乏[1]。為了提高林木的生產力，林木施肥日益受到林業生產者的重視，但大量投入的磷肥僅有一小部分被林木吸收利用，絕大多數磷迅速轉化成難溶性的磷存在于土壤中，或是被雨水沖刷進入水體中[2]。因此，研發土壤磷素利用效率的高效微生物磷肥十分迫切。

馬尾松(PinusmassonianaLamb.)是廣西主要的用材林樹種之一，同時也是我國主要的松脂生產樹種[3]。研究表明，不同種源和家系的馬尾松吸收和利用土壤磷素能力存在顯著差異，磷素缺乏對馬尾松根系構型和生長有顯著的影響[4，5]，磷素是影響馬尾松生長的主要因子[6]。根際是植物與土壤進行物質交換最活躍的界面，有研究表明根際土壤解磷微生物數量比非根際高1～2個數量級[7]。因此，本研究對廣西馬尾松根際土壤溶磷菌進行了分離篩選，以期篩選出高效的溶磷菌株，為進一步研制微生物磷肥提供基礎資料和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

馬尾松根際土壤樣品采集自廣西主要馬尾松種植區，包括寧明廣西國有派陽山林場、梧州和田林等地。在樹木周圍多點挖取0～20cm土層內的根系，先將大塊不含根系的土壤抖落，然后取近根系表面的細粒土壤，裝入無菌自封袋內混勻，作為根際土壤。所有試劑均為分析純或化學純。

溶磷菌篩選培養基采用NBRIP培養基，制作方法參考文獻[8]。細菌分離、純化和培養采用營養瓊脂和LB培養基，分別購買自廣東環凱微生物科技有限公司和北京索萊寶科技有限公司。溶磷效果測定采用PVK(Pikovskaya)液體培養基，制作方法參考文獻[9]。

1.2 方法

1.2.1 溶磷菌的篩選與分離

稱取10g土樣溶于90mL無菌水中，用10倍稀釋法分別配制10-3、10-4g/mL的土壤懸液，分別涂布到分離培養基上，35℃倒置培養3d，觀察出現溶磷圈的菌落，測定溶磷圈直徑(D)、菌落直徑(d)，根據能否產生溶磷圈與D/d值大小來初步確定菌株的溶磷能力。挑選D/d值≥1.5的菌株，利用平板劃線純化的方法，將菌株進行分離純化。4℃下保存于營養瓊脂斜面，-20℃下保存菌種于甘油管中。

1.2.2 溶磷菌溶磷效果的測定

將分離純化獲得的細菌挑取一環，接種到LB培養基中，取生長在對數期的菌液，以1%(v/v)的接種量接入到PVK培養基中，35℃、180r/min恒溫搖床震蕩培養3d。取發酵液5mL 4000r/min離心3min，取上清液測定有效磷含量和pH。設不接菌為對照，每個處理重復3次。

用pHS-3C型酸度計測定發酵液的pH；取發酵上清液稀釋適當倍數，利用731型紫外可見分光光度計在700nm波長處通過鉬銻抗比色法[10]測定光密度值并計算有效磷含量，溶磷量為接種菌液扣除對照的有效磷含量；數據采用Excel預處理后，用SPSS 17.0進行統計分析。

1.2.3 溶磷菌的分子生物學鑒定

細菌總DNA提取采用天根生化科技(北京)有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒，具體操作按照試劑盒說明書進行。

以提取的細菌DNA為模板，采用通用引物27F和1492R進行16S rDNA的PCR擴增，擴增反應在Biometra EasyCycler Gradient PCR儀上進行。PCR反應體系50μL，其體系為2×Es Taq MasterMix 25μL，27F(10μmol/L)1μL，1492R(10μmol/L)1μL，DNA模板1μL，雙蒸水22μL。PCR擴增程序為：94℃預變性2min；94℃變性0.5min，56℃退火0.5min，72℃延伸1min，35個循環；72℃終延伸2min。

用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測，產物和Marker上樣量均為3μL，電泳結果于上海天能5200Multi全自動化學發光/熒光圖像分析系統成像。PCR產物經試劑盒純化后送至南寧國拓生物科技有限公司進行測序，測序結果在NCBI上進行Blast比對，并通過軟件Clustal X 1.83和MEGA 4.0構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 菌株分離結果

從馬尾松根際分離獲得1株溶磷菌株，標記為DP07。

2.2 溶磷菌的溶磷效果

表1 液體搖瓶培養條件下的溶解效果

將分離到的菌株，接種到PVK液體培養基中進行液體發酵試驗，搖瓶培養3d后測得發酵液中的有效磷含量和pH變化(表1)。

由表1可知，菌株DP07在培養3d后，對5.0g/L的磷酸三鈣溶液的溶磷量達到(3.599±0.24)mg/L，是對照(CK)的3倍。搖瓶培養3d后，對照處理和接種菌株處理培養液的pH均有一定程度的下降，接種菌株處理比對照(CK)的pH低近1個單位。

圖1 DP07在NBRIP培養基上的菌落和菌體(1000×)

2.3 菌體形態

分離到的菌株DP07在NBRIP培養基上培養3d后的形態、透明圈和革蘭氏染色結果見圖1。由圖1可知，菌株DP07為短桿狀，革蘭氏染色陰性，具運動性。

2.4 分子生物學鑒定

利用通用引物，對溶磷菌株DP07的16S rDNA基因片段進行PCR擴增，得到長度約為1500bp的擴增產物。將其在NCBI網站的blatn數據庫中進行在線blast比對分析，結果發現菌株DP07與Burkholderiaphenaziniumstrain A1(Genbank登錄號：NR_029212.1)的序列相似度達到99%。根據比對結果進行菌株DP07的系統發育分析如圖2所示。

圖2 菌株DP07系統發育樹

3 結論

從廣西馬尾松根際篩選獲得溶磷菌株1株，經菌落觀察及分子生物學初步鑒定，確定菌株DP07為Burkholderiaphenazinium。

通過液體發酵試驗，測定其對難溶性磷酸三鈣的溶解效果。結果表明，搖瓶培養3d后，溶磷量達到(3.599±0.24)mg/L，pH也有明顯下降。