熒光顯微鏡自組實驗設計

劉東奇

(南開大學 物理科學學院，天津 300071)

熒光顯微鏡在諸多領域都有著重要的應用. 在物理方面，熒光顯微鏡在量子點和色心缺陷等零維材料、碳納米管和金屬納米線等一維材料、二硫化鉬和其他過渡金屬硫化物等二維材料、各類熒光晶體等三維材料的熒光特性研究中是必不可少的研究工具[1-4]；在生物、醫藥方面，觀察蛋白質、DNA、生物細胞、組織等的結構和探求作用機理，以及藥物顆粒傳輸、藥物作用效果時常用到的各類熒光標記物都可以在熒光顯微鏡或性能優異的超分辨熒光顯微鏡上觀測[5-7]. 目前，熒光顯微鏡的應用領域變得越來越廣泛，也是許多熱點研究問題的有力表征手段，而相應的光學基礎實驗教學內容還處于空白狀態.

把熒光顯微鏡的基本原理、光路構造、技術特點、實際應用等方面綜合起來作為理工科學生、尤其是物理學科本科學生光學實驗的一部分將是有益的嘗試. 本文設計了基于光學平臺的熒光顯微鏡自組實驗，學生通過自行設計、光路搭建調節，組裝完成熒光顯微鏡設備，讓學生掌握熒光成像原理，優化成像條件，完成熒光圖像和熒光光譜的采集.

1 熒光顯微鏡的設計和光路搭建

熒光顯微鏡的主要光學元件從大恒光電公司和索雷博公司購置，安裝在支桿和底座組成的支架上，便于在光學面包板上調節光學元件的高度和位置.

熒光顯微鏡光路的搭建步驟為：

1)將激光器和白光光源置于光學面包板上的合適位置，通過調節各自支架的俯仰旋鈕，使激光光束和白光光束軸向平行且高度一致；

2)將一反射鏡鏡面調節到與白光光路成45°放置，將另一反射鏡放置于一維平移臺上，其鏡面與激光光路成45°，推開平移臺時白光光束照射樣品，推入平移臺時激光光束照射樣品；

3)雙色鏡與入射光路成45°放置，入射光依次經過雙色鏡、透鏡、物鏡后照射到裝載于三維手動平移臺的樣品上，樣品受激發出的熒光經雙色鏡透射進入后方熒光采集光路；

4)將一反射鏡裝載于一維平移臺上，其鏡面與熒光光路成45°，推開平移臺時熒光進入后方的光譜儀完成光譜測量，推入平移臺時熒光進入后方的CCD完成熒光圖像采集.

搭建的熒光顯微鏡主要光路如圖1所示. 所用反射鏡為鍍銀反射鏡，可見光區域的反射率大于95%；透鏡為凸透鏡，焦距為50 mm；所用熒光樣品為CdTe/CdS量子點，通過移液槍吸取50 μL濃度為0.2 mg/mL的量子點懸濁液，滴涂在170 μm厚度的石英載玻片上制備而成. 熒光顯微鏡采用反射式光路，激光和白光光束均通過物鏡照射到樣品上，樣品受激發射的熒光通過同一物鏡被后方熒光光路收集. 激光激發光路和白光照明光路可以通過裝載于一維手動平移臺的反射鏡進行光路的自由切換. 熒光收集光路可以通過裝載于一維手動平移臺的反射鏡實現光譜探測光路和CCD成像光路的自由切換.

圖1 熒光顯微鏡光路圖

2 熒光顯微鏡性能測試

2.1 熒光顯微鏡光學分辨率測量

利用標準光學分辨率板在白光照明條件下測熒光顯微鏡的空間分辨能力. 將圖1中接入激光光束的反射鏡(裝載于一維手動平移臺上)移開，白光光束可照射到樣品上. 同時，將熒光光路中的反射鏡(裝載于一維手動平移臺上)移入，CCD相機可采集圖像. 圖2是選用放大倍數40倍、數值孔徑為0.6的物鏡拍攝的標準光學分辨率板的圖像. 組裝完成的熒光顯微鏡可分辨700 lp/mm的線對，相應的光學分辨率為714 nm. 對于配備數值孔徑為0.6物鏡的該熒光顯微鏡，白光照明下其光學分辨率接近此處的光學衍射極限.

圖2 白光照明下熒光顯微鏡拍攝的 標準光學分辨率板的圖像

2.2 熒光光譜測量和熒光圖像采集

熒光顯微鏡所配的光譜儀型號為海洋光學QE65000型光纖光譜儀，測量光源光譜時可以將光纖直接對準光源光束進行光譜采集，測量熒光光譜時可以直接接入熒光光路進行光譜數據采集. 學生在使用光纖光譜儀時，需要將光源強度調低，避免光強度超過光譜儀量程，長時間采集時損壞儀器. 可以將接入光譜儀的一端光纖拔下對準紙面通過肉眼觀察耦合進入光纖的光源強度，將光源調節到合適強度后再將光纖一端接入光譜儀進行光譜數據采集. 圖3(a)是白光光源的光譜，光譜范圍400～1 050 nm. 圖3(b)是激光光譜和樣品的熒光光譜，激光波長為561 nm，所用樣品為CdTe/CdS量子點，熒光范圍650～800 nm，熒光峰位于720 nm處.

(a)白光光源的光譜

(b)激光光譜和樣品的熒光光譜圖3 白光光源光譜和激光光源及相應熒光光譜

將圖1中接入激光光束的反射鏡(裝載于一維手動平移臺上)移入，白光光束被阻擋，激光光束可以照射到樣品上. 同時，將熒光光路中的反射鏡(裝載于一維手動平移臺上)移入，CCD相機可以采集相應熒光圖像. 圖4(a)是激光照射下拍攝的帶有十字型標記的樣品的熒光圖像，圖中顏色為偽色，粉紫色區域熒光強度最強，藍色區域熒光強度次之，綠色區域熒光強度較弱，紅色區域熒光強度最弱. 作為對比，圖4(b)是白光照明下拍攝的相同區域的樣品圖像. 從圖4中可以看到，白光照明圖像中的十字型標記清晰可見，圖中白色區域為無量子點或量子點稀少的區域，灰色區域是量子點團聚的區域. 熒光圖像和白光照明圖像中的十字型標記形狀一致，熒光圖像中的十字型標記主要呈現紅色，表明十字型標記位置為無量子點或量子點稀少的區域；而熒光圖像兩側的紅色區域為激光光斑未照射到的區域或激光光斑強度極弱的區域，該區域不發出熒光或發出極弱的熒光，主要呈現紅色；熒光圖像中呈現粉紫色的區域是量子點團聚程度最高的區域，熒光強度最高. 在白光照明圖像中各個量子點團聚區域的內部的襯度較為一致，內部細節區別不明顯，而熒光圖像可以更為清晰地判斷白光照明圖像中襯度基本一致的區域內哪些位置處的量子點分布更多，熒光強度更強，尤其是量子點團聚的點狀區域在熒光圖像中表現更為直觀.

(a)激光照射下拍攝的帶有十字型標記的樣品熒光圖像

(b)白光照明下拍攝的相同區域的樣品圖像 圖4 樣品的熒光圖像及相同區域白光成像

2.3 改進和拓展

自行設計、組裝的熒光顯微鏡可以實現穩定工作，其光路切換簡單快捷. 除目前所用光譜儀價格較貴外，其他光學元件的經濟成本都在可接受范圍. 對于光譜儀，可選用國產廠家的光纖光譜儀或普通光譜儀，價格便宜.

熒光顯微鏡自組實驗的設計初衷是建立1套開放式系統，可以根據實驗教學需要在后期的實際使用過程中自行加入其他光學模塊實現相應功能，比如加入多路激光光路、偏振光路等.

3 結束語

基于光學平臺的光學自組實驗，學生將通過自行設計熒光顯微鏡光路，組裝集白光照明成像、激光激發熒光成像、熒光光譜探測等功能于一體的開放式系統. 整個系統原理簡單、結構緊湊，與前沿科學研究聯系更為緊密，適合于作為理工科尤其是物理學科本科生的光學實驗內容. 該實驗可以讓學生完成基本光路調節的技能培養和熒光顯微鏡基本原理等知識的獲取，學生還可以進一步根據需要擴展此系統的功能，完成探究型物理實驗的內容.