不同無機鹽濃度對金霉素發酵生產影響

婁百勇 宋祺 曹華偉 楊永 宋偉

摘 要：目的：通過對金霉素發酵配方中各無機鹽配比進行優化，篩選最有利于金霉素生產的濃度比例提高金霉素發酵效能。方法：通過利用部分因子設計方法設計出不同組合的無機鹽配方進行初篩試驗篩選對金霉素發酵效能有促進作用的幾個無機鹽配比組合，綜合考慮無機鹽組分和其它成分的影響，采用響應曲面優化方法進一步優化金霉素發酵無機鹽配方。結果：優化后金霉素發酵基礎配方中無機鹽配比為氯化鈉0.23%，硫酸銨0.63%，碳酸鈣0.57%，硫酸鎂0.025%，磷酸二氫鉀0%，且單批金霉素發酵效價及正放產量較初始配方條件分別提高852μ/ml和261kg，實現增產增效的目的。同時發現不同硫酸銨濃度對菌絲形態有一定影響。結論：不同無機鹽濃度對金霉素發酵有一定影響，經優化后金霉素發酵效能得到進一步提高。

關鍵詞：無機鹽濃度；金霉素；發酵；效價；正放產量

中圖分類號：TQ927 文獻標志碼：A 文章編號：2095-2945（2018）27-0043-04

Abstract： Objective： to optimize the proportion of inorganic salts in chlortetracycline fermentation formula， and to select the best concentration ratio for chlortetracycline production to improve the efficiency of chlortetracycline fermentation. Methods： different combinations of inorganic salts were designed by using partial factor design method to screen out several combinations of inorganic salts which could promote the fermentation efficiency of chlortetracycline. Considering the effects of inorganic components and other components， response surface methodology was used to further optimize the formula of chlortetracycline fermentation inorganic salts. Results： the optimized basic formula of chlortetracycline fermentation was composed of sodium chloride 0.23%， ammonium sulfate 0.63%， calcium carbonate 0.57%， magnesium sulfate 0.025%， potassium dihydrogen phosphate 0%. 852 μ/ml and 261 kg. At the same time， it was found that different concentration of ammonium sulfate had some effect on the morphology of mycelium. Conclusion： different concentrations of inorganic salts have some effects on the fermentation of chlortetracycline， and the fermentation efficiency of chlortetracycline can be further improved after optimization.

Keywords： inorganic salt concentration； chlortetracycline； fermentation； potency； positive release yield

金霉素（Chlortetracycline），四環素類的一種廣譜抗生素，在醫療、畜牧業和農業上有廣泛的用途。在畜牧業上是用于飼料藥物添加劑的八大抗生素產品之一，金霉素以其抑菌、促生長、飼料利用率高，在機體內殘留量低等特點，成為目前及今后較長時間內在飼料工業中用量最大的抑菌促生長劑。

金霉素的生物合成是一項十分復雜的過程，影響其合成的因素也很多，如種子質量、原料配方、工藝條件以及發酵過程的代謝調控等。我國從上世紀50年代開始生產金霉素， 過半個多世紀的發展，目前國內生產廠家以CaCO3，MgSO4，NaCl，（NH4）2SO4，CaCl2，KH2PO4作為主要發酵基礎無機鹽原料，發酵周期100小時左右，效價可達到20000-25000u/mL。[1]

無機鹽是微生物生長和代謝不可或缺的重要營養成分，對微生物生長代謝有重要影響，是很多代謝途徑所需要的酶激活劑。來源于農作物原料的復合培養基中無機鹽種類豐富，但其含量可能不能滿足微生物快速生長和代謝的要求，勢必影響發酵產量。在培養基成分設計和優化過程中，由于無機鹽的作用不如其它營養成分突出，加之基質中存在的本底含量，常是被忽略的對象。因此，基于無機鹽添加，優化金霉素發酵生產的復合培養基配方，對研究金霉素發酵高產條件有重要意義。[2]目前，關于金霉素合成的研究多是從工藝條件或代謝調控方面，有研究培養基也主要是從主要碳源玉米淀粉等著手，還沒有專門針對發酵培養基中無機鹽濃度配方方面的研究報道。

本實驗通過利用部分因子設計方法設計出不同組合的無機鹽配方進行初篩試驗篩選對金霉素發酵效能有促進作用的幾個無機鹽配比組合，綜合考慮無機鹽組分和其它成分的影響，采用響應曲面優化方法進一步優化得到金霉素發酵基礎培養基無機鹽配方： 氯化鈉0.23%，硫酸銨0.63%，碳酸鈣0.57%，硫酸鎂0.025%，磷酸二氫鉀0%。無機鹽優化后單批金霉素發酵效價及正放產量較初始配方條件分別提高852μ/ml和261kg，實現金霉素發酵生產增產增效的目的。同時發現不同硫酸銨濃度對金霉素菌絲形態有一定影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

金色鏈霉菌（Streptomyces aureus）， 由駐馬店華中正大有限公司制備并保藏。

1.1.2 初始培養基配方

種子培養基%（kg/L）：玉米淀粉8，酵母粉2，黃豆餅粉4.8，玉米漿0.28，氯化鈉0.2，硫酸銨0.48，碳酸鈣0.64，硫酸鎂0.048，磷酸二氫鉀0.072。

發酵培養基%（kg/L）：玉米淀粉6，花生餅粉2，酵母粉0.65，黃豆餅粉1，菌體蛋白0.27，氯化鈉0.2，硫酸銨0.67，碳酸鈣0.6，硫酸鎂0.022，淀粉酶0.007，玉米漿1.4，磷酸二氫鉀0.01。

1.1.3 主要儀器及設備

8m3種子罐，溫州石油化工機械廠；60m3發酵罐，溫州石油化工機械廠；60m3糖罐，溫州石油化工機械廠；近紅外光譜分析儀（NIRS），福斯華（北京）科貿有限公司（FOSS）。

1.2 方法

1.2.1 發酵培養方法

（1）種子罐培養方法：種子罐接種后，在溫度26-33℃，罐壓0.040-0.060Mpa條件下培養19-25h。

（2）發酵罐培養方法：發酵培養基滅菌后，待種子罐培養結束，移入發酵罐后在溫度28-34℃，菌絲長好后降溫至29±3℃培養。過程中pH控制在5.9±0.5，培養壓力控制在0.001-0.040MPa，同時通過補料控制合適的總糖和氨基氮，培養90-124hr后，發酵液氨基氮上升、菌絲老化、補糖量、通氨量降低時，即可正放到提煉進行處理。

1.2.2 發酵液樣品分析與檢測方法

培養過程中每8小時取一次樣，除pH需用pH計檢測外，其余各參數：總糖，氨基氮，效價均運用近紅外光譜分析儀掃描檢測。

1.2.3 數據統計分析工具：minitab 15.0

1.3 研究過程

1.3.1 部分因子設計進行初篩試驗

利用minitab 15.0軟件進行部分因子試驗設計。試驗設計在初始無機鹽配方的基礎上進行，其中初始配方見表1，因考慮到試驗風險問題，對試驗配方調整幅度進行控制，控制幅度見表2，最終試驗設計結果如表3所示。本試驗設計因子數5，水平數12，區組數1，仿行數：1，中心點：1，最終得到17次試驗。

1.3.2 響應曲面優化設計

在部分因子設計所得結果基礎上，進行響應曲面優化設計得出獲得最優發酵效能的無機鹽配方組合并進行60m3發酵罐生產驗證。

2 結果與分析

2.1 部分因子設計試驗初篩驗證結果

對部分因子設計所得17次試驗進行驗證后對其放罐效價及正放產量進行統計分析得知：配方一，配方三，配方六，配方八，配方十二，配方十三，配方十五在17次試驗中同時滿足放罐效價，干物質CTC含量和正放產量在21000μ/ml，210g/kg及7000kg以上（結果見表4）

2.2 響應曲面優化設計

對初篩試驗獲得的七組配方進行第二次上罐試驗驗證，對所得結果利用minitab軟件進行響應曲面優化設計，得到金霉素發酵過程以30m3的計料體積最優無機鹽配方為氯化鈉70kg，硫酸銨190kg，碳酸鈣170kg，硫酸鎂7.6kg，磷酸二氫鉀0kg（配比為：氯化鈉0.23%，硫酸銨0.63%，碳酸鈣0.57%，硫酸鎂0.025%，磷酸二氫鉀0%），此配方預計所得放罐效價，干物質CTC含量以及正放產量分別為24651μ/ml，209g/kg，7822kg。具體見圖1。

2.3 最優無機鹽配方的初步驗證（10批）

按照響應優化器所得最優無機鹽配方進行上罐（60m3）初步驗證后得知，優化后的無機鹽配方所得放罐效價和正放產量較優化前分別提高532μ/ml和295kg具體見圖2（a）和圖2（b）。

2.4 最優無機鹽配方的60m3發酵罐生產推廣情況

通過初步驗證結果得到優化后的配方在促進金霉素合成提高金霉素發酵效價及正放產量存在明顯的優勢，所以將此配方在60m3發酵罐上進行全部推廣驗證（總批次為36批），最終結果為放罐效價和正放產量較優化前分別提高852μ/ml和261kg，具體見圖3（a）和圖3（b）。且從圖4可看出，試驗罐批與對照罐批pH控制和過程氨基氮變化趨勢以及效價增長情況差異不明顯，但對照罐批前期糖耗較快，且從DO和粘度來看，對照罐批前期代謝較試驗旺盛。

2.5 不同硫酸銨濃度對金霉素菌絲形態的影響

在本次試驗過程中通過對菌絲形態對比發現不同的硫酸銨配比對金霉素菌絲形態有不同影響，當硫酸銨配比為0.63%時，使得菌絲17小時開始分化出現節孢子，而0.7%的硫酸銨罐批19小時并未出現明顯分化現象，且試驗批32小時大量開始分化，而對照批34小時開始分化出節孢子。（見圖5）故硫酸銨對金霉素菌絲分化有一定影響，后續需繼續研究。[3]

3 結語

本研究運用部分因子試驗設計和響應曲面優化方法對金霉素發酵基礎培養基中不同無機鹽原料（CaCO3，MgSO4，NaCl，（NH4）2S

O4，CaCl2，KH2PO4）濃度進行優化，得到最優配比為氯化鈉0.23%，硫酸銨0.63%，碳酸鈣0.57%，硫酸鎂0.025%，磷酸二氫鉀0%，且單批金霉素發酵效價及正放產量較初始配方條件分別提高852μ/ml和261kg，實現增產增效的目地。且通過對菌絲形態進行對比發現不同硫酸銨濃度金霉素菌絲分化程度有一定的影響。

4 展望

本研究由于是在實際生產過程中進行，由于考慮到生產效能，且受生產工藝規程限定，未進行單因素跨度較大的試驗來確定各個無機鹽最適濃度，直接綜合考慮所有無機鹽濃度，且關于硫酸銨對金霉素菌絲形態的影響也未研究徹底，在今后的研究中， 將針對以上不足展開研究，選擇出各個無機鹽濃度的單一因素條件下的最佳配比，然后在此基礎上繼續進行綜合驗證， 同時結合菌絲形態研究找到最適的硫酸銨濃度，提高金霉素產量，降低生產成本。

參考文獻：

[1]卜令軍，等.不同產地玉米淀粉對金霉素發酵影響的初步研究[J].科技展望，2017，04.

[2]張由恒，等.無機鹽對多殺菌素發酵產量影響[J].文章編號：1001-8689（2016）09-0658-08.

[3]王娟，等.頭孢菌素C發酵過程中硫酸銨加量對菌絲形態及其效價的影響[J].求醫問藥下半月刊，2011，9（7）.