扶脾柔肝方對肝纖維化大鼠肝臟過氧化物酶體增殖物激活受體-γ與轉化生長因子-β1表達的影響

安禎祥 何遠利 王 敏 黃 丹 陳昱江

(貴陽中醫學院第一附屬醫院，貴州 貴陽 550001)

肝纖維化(HF)是細胞外基質(ECM)在肝內過量沉積，是慢性肝病發展成為肝硬化的樞紐。而肝星狀細胞(HSC)的表型轉化和ECM的異常分泌在HF的發生發展進程中起著關鍵作用。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ在HF過程中發揮重要的調控作用，是一種HSC里的配體激活轉錄因子，通過調控轉化生長因子(TGF)-β/Smads信號通路，使ECM合成減少，以減緩HF發展，從而發揮拮抗HF作用〔1，2〕，是潛在的治療HF的作用靶點〔3〕。扶脾柔肝方(FRF)是治療肝硬化腹水的臨床經驗方，依據“肝脾相關”理論擬定，具有健脾柔肝，益氣活血作用，在臨床運用多年，有較好的療效〔4～7〕。研究表明，FRF具有調節TGF-β1/Smads信號通路表達水平，降低α-平滑肌肌動蛋白(SMA)，拮抗HF作用〔8,9〕。本文探討FRF對HF大鼠肝組織PPAR-γ及TGF-β1表達的影響，進一步探討其抗HF的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1藥物 FRF藥物組成：黃芪30 g、麩炒白術30 g、蒼術15 g、苡仁30 g、當歸15 g、牛膝15 g、丹參30 g、莪術15 g、枳殼15 g(華潤三九醫藥股份有限公司配方顆粒制劑，批號分別為1504001w，1502001w，1502001w，1502001s，1502002w，1502001w，1503002s，1503001w，1410001w)，由我院中藥房提供。扶正化瘀膠囊(上海黃海制藥，國藥準字Z200220073)。秋水仙堿片(云南玉溪制藥，國藥準字H53021904)。

1.2動物 SPF級SD大鼠，雌雄各半，5周齡，體重(180±20)g，許可證號：SCXK(渝)2012-005，動物及飼料均購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司。

1.3試劑 四氯化碳(CCl4，天津市光復科技發展有限公司，批號20120506)；透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、Ⅲ型前膠原N端肽(PⅢNP)(鄭州安圖生物技術有限公司，批號分別為20140709，20140720，20140816，20140702)；SP試劑(河南賽諾特生物)；十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)制備試劑盒(北京康為世紀 CW0022)；PPAR-γ一抗(Santa公司，批號L0114)；TGF-β1一抗(Immuno Way公司，批號YM3438)；β-actin一抗、ECL熒光顯影劑(康為世紀，批號分別為CW0096A，CW0048A)；RNA提取試劑(北京天根生化，DP405-02)。

1.4儀器 HF指標檢測儀器，ADC CLIA 400型(山東艾德康公司)；渦旋振蕩儀，QL-902型(江蘇其林貝爾公司)；qPCR儀，ABI 7500型(美國ABI公司)；電泳儀，164-5050型(美國Bio-Rad公司)；紫外分光光度計，NANODROP 2000型(美國Therno scientific公司)。

1.5動物分組、造模及給藥 大鼠隨機分為7組：正常對照組12只，模型組12只，秋水仙堿(0.2 mg/kg)組11只，扶正化瘀組(0.415 g/kg)11只，FRF大劑量(80 g/kg)組12只，FRF中劑量(40 g/kg)組11只，FRF小劑量(20 g/kg)組11只。造模方法參考文獻〔10〕。HF標準參照文獻〔11〕。50%CCl4橄欖油溶液背部皮下注射，劑量3 ml/kg，每周2次，實驗第2周起按10 ml/kg灌胃30%乙醇，隔天1次。正常對照組予等量橄欖油背部皮下注射和生理鹽水灌胃。造模10 w，第11～14周連續灌胃相應藥物，劑量10 ml/kg。正常對照組及模型組灌胃生理鹽水。實驗結束后，禁食12 h，稱重，腹主動脈采血，取血清，動物處死，留取肝臟組織備檢測。

1.6血清HF指標檢測 全自動化學發光免疫分析儀檢測HA、LN、Ⅳ-C、PⅢNP。

1.7病理學檢測 標本予甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察HF程度。

1.8免疫組化法檢測肝組織中PPAR-γ的表達 操作按照免疫組化方法說明書進行。肝組織固定，切片，脫蠟，修復抗原，加羊血清工作液，加PPAR-γ一抗(1∶100)，4℃孵育過夜，加二抗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，封片，顯微鏡觀察。陽性表達為有棕黃色著色。采用YPS-2000病理圖文系統進行分析，每張切片隨機取5個視野(×400)，計數陽性百分率，取平均值進行分析。

1.9qRT-PCR法檢測PPAR-γ、TGF-β1 mRNA的表達 引物由Invitrogen(北京)公司合成。內參GAPDH(131 bp)上游引物：5′-CCTTCCGTGTTCCTACCCC-3′；下游引物：5′-GCCCAGGATGCCCTTTAGTG-3′。PPAR-γ(134 bp)上游引物：5′-TACCACGGTTGATTTCTC-3′,下游引物：5′-GCTCTACTTTGATCGCACT-3′。TGF-β1(182 bp)上游引物：5′-CTGGATACCAACTACTGCTTCA-3′，下游引物：5′-AGGACCTTGCTGTACTGTGT-3′。Trizol法提取肝組織總RNA，檢測RNA純度和濃度。擴增程序：95°30 s，(95℃ 5 s，60℃ 40 s)×45個循環。RealTime反應體系：2×mix 10 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，模板2 μl，加入滅菌蒸餾水至20 μl。2-△△CT法計算PPAR-γ、TGF-β1的相對表達。

1.10Western印跡法檢測PPAR-γ、TGF-β1蛋白的表達 提取蛋白并定量，凝膠電泳，轉膜，室溫封閉10 min，將一抗(1∶500)，二抗(1∶200)按比例加入4 ml離心管中，反應5 min，加入4 ml抗體稀釋液，將封閉好的膜轉移到裝有抗體混合液的盒子中，室溫孵育，4℃過夜，洗滌，ECL曝光顯影。以β-actin作為內參，目標蛋白相對表達量用目標蛋白與內參蛋白灰度值的比值相對于對照組的比值表示。

1.11統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，等級資料比較采用非參數檢驗。

2 結 果

2.1一般情況 實驗中處死正常對照組大鼠2只，處死模型組和FRF小劑量組各1只，秋水仙堿組死亡2只，FRF大劑量組死亡1只。正常對照組大鼠行為及飲食正常，體重逐漸增加。其余各組有皮膚潰爛現象。模型組大鼠皮毛干澀無光澤，反應遲鈍，飲食、活動減少，體重增長緩慢。各藥物組較模型組有所改善。

2.2血清HF指標比較 與正常對照組比較，模型組指標顯著升高(P<0.01)，與模型組比較，各藥物干預組HA、Ⅳ-C、PⅢNP均有降低(P<0.05)，其中扶正化瘀組、FRF中、大劑量組降低明顯(P<0.01)，LN除外FRF小劑量組外，其余各組降低差異有統計學意義(P<0.05)，與秋水仙堿組、扶正化瘀組比較，FRF各劑量組HF水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3病理學變化比較 HE染色光鏡下可見模型組肝細胞變性壞死，肝小葉結構破壞，纖維組織增生，部分有假小葉形成，各藥物干預組較模型組有明顯減輕。與模型組比較，各藥物干預組HF分期有明顯改善(P<0.01，P<0.05)。見表2。

2.4免疫組化檢測肝組織PPAR-γ的表達 PPAR-γ陽性顆粒主要分布于細胞質內，呈棕黃色顆粒，與正常對照組〔(36.86±7.77)%〕比較，模型組PPAR-γ表達明顯減少〔(7.55±2.86)%，P<0.01〕；與模型組比較，秋水仙堿組〔(12.31±4.57)%〕、扶正化瘀組〔(13.27±4.75)%〕、FRF小劑量組〔(11.82±3.27)%〕、FRF中劑量組〔(13.75±4.09)%〕及FRF大劑量組〔(25.07±6.97)%〕均有效增加PPAR-γ表達，其中尤以FRF大劑量明顯(P<0.01)；與秋水仙堿組、扶正化瘀組比較，FRF大劑量組表達增加(P<0.05)。見圖1。

表1 FRF對HF大鼠血清肝纖維化指標的影響

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05

表2 FRF對大鼠HF分期的影響(n)

與模型組比較：1)P<0.01，2)P<0.05

圖1 FRF對HF大鼠肝組織PPAR-γ蛋白表達的影響(DAB，×400)

2.5各組大鼠肝組織PPAR-γ、TGF-β1 mRNA的表達 與正常對照組比較，模型組PPAR-γ mRNA表達顯著下調(P<0.01)；與模型組比較，各藥物干預組肝組織中PPAR-γ mRNA表達上調，其中扶正化瘀組、FRF大、中劑量組差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；與秋水仙堿組、扶正化瘀組比較，FRF各劑量組表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 FRF對HF大鼠肝組織PPAR-γ、TGF-β1 mRNA表達的影響

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05

2.6Western印跡檢測各組肝組織PPAR-γ、TGF-β1蛋白的表達 與正常對照組比較，模型組PPAR-γ蛋白表達明顯減少(P<0.01)，TGF-β1蛋白表達明顯上調(P<0.01)；與模型組比較，各藥物干預組PPAR-γ蛋白表達均有增加，其中以扶正化瘀組、FRF中、大劑量組較為明顯(P<0.01)，與模型組比較，各藥物干預組TGF-β1蛋白表達均有明顯下調(P<0.01，P<0.05)。見表4、圖2。

表4 FRF對HF大鼠肝組織PPAR-γ、TGF-β1蛋白表達的影響

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

1～7：正常對照組、模型組、秋水仙堿組、扶正化瘀組、FRF小劑量組、FRF中劑量組、FRF大劑量組圖2 FRF對HF大鼠肝組織PPAR-γ、TGF-β1蛋白表達的影響

3 討 論

HF實質是ECM在肝內過量沉積。HA是ECM的主要成分，可較準確地反映HF的程度、活動性，HA水平是反映HF最具價值的血清學指標〔12〕。血清LN增高與其纖維化程度呈正相關，纖維化后期增高尤為明顯〔13〕。本研究結果顯示，肝組織中膠原代謝異常，經FRF干預后HA、LN、Ⅳ-C、PⅢNP的含量均有降低，其中FRF中、大劑量組降低明顯，說明該方具有減少HF肝組織細胞外基質異常增生的作用，推測其調節膠原代謝是其抗肝纖維化的機制之一。

HF的進行性發展與PPAR-γ的表達量減少和功能異常有關〔14〕。HF程度越重，PPAR-γ表達越低，而α-SMA表達越高，PPAR-γ表達的下降可能使α-SMA的數量增加，加速HF的形成〔15〕。HF的關鍵節點是HSC的表型轉化。PPAR-γ參與HSC靜止表型的維持，靜止狀態的HSC特征性表達PPAR-γ，HSC激活后，PPAR-γ表達急劇下降，過量表達α-SMA，HSC由靜止向活化表型轉化〔16～19〕。PPAR-γ過量表達能使活化的HSC細胞向靜止表型轉變，降低Ⅰ型膠原蛋白、α-SMA水平，抑制HSC增殖、活化及遷移，從而達到抗HF的作用〔20，21〕。TGF-β1在HSC 活化中起著重要作用，可以促進ECM的合成，抑制其降解。PPAR-γ的變化與TGF-β1的表達存在相關性，PPAR-γ的激活可能通過TGF-β1途徑調節HF的進程〔22〕。PPAR-γ活化可以抑制TGF-β1/Smad信號通路表達，抑制HSC的活化，促進HSC凋亡，抑制ECM生成，有效地抑制HF的發生發展〔23〕。本研究表明，FRF上調纖維組織PPAR-γ表達水平，降低TGF-β1表達，可能是其抗HF作用機制之一。