miRNA-350靶向MAPK14及JNK調(diào)控H9c2細(xì)胞增殖和凋亡

張淑華 洪 浪 王云霞 吳志婷 劉秋玲 葛郁芝

(江西省人民醫(yī)院 江西省心血管病研究所，江西 南昌 330006)

細(xì)胞凋亡是指機體在有害物質(zhì)、破損細(xì)胞等體內(nèi)外誘導(dǎo)因素下激活細(xì)胞內(nèi)某些編碼基因而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，是程序性死亡的一種〔1〕。microRNA(miR)通過對靶基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控，廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、病變、修復(fù)和凋亡等多種生命活動〔2〕。大量研究表明miRs參與急性心肌梗死、缺血再灌注、氧化應(yīng)激等多種情況下心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控〔3～5〕，另有報道肥大的心肌細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡〔6〕。從壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠的心肌組織中篩選到異常表達(dá)的miR-350〔7〕，并對其作用機制進(jìn)行探索，研究過程中發(fā)現(xiàn)miR-350引起細(xì)胞肥大的同時，心肌細(xì)胞凋亡也增加。該現(xiàn)象是否和miR-350有直接關(guān)系呢？心肌細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，不具有再生和增殖能力，而大量心肌細(xì)胞凋亡，死亡是多種心血管疾病導(dǎo)致的心臟功能損害由代償性向失代償轉(zhuǎn)變的重要因素〔8〕。明確心肌細(xì)胞凋亡機制對心血管疾病的預(yù)防與治療有著重要意義。本研究利用特殊化學(xué)修飾的miR拮抗劑抑制miR-350的表達(dá)，從正反兩個方向深入研究。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞購自ATCC；杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、胰酶、抗生素、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)等購自Gibco公司。胎牛血清購自PAA公司，F(xiàn)uGene HD購自Roche公司，Trizol購自Invitrogen公司，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司，RNasin和dNTP購自TaKaRa公司。AnnexinV-PE凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司，核酸序列均由上海生工合成。miR-350基因序列：GTGAAAGTGTATGGGCTTTGGGAATTCAAGAGATTCACA AAGCCCATACACTTTCAC；miR-350拮抗劑(antagomir)序列：5′-GUGAAAGUGUAUGGGCUUUGUGAA-3′ (miR-350 anti)。miR-350突變(mutant)序列：5′-GUCAAUGUGAUAGCGCUCACGUAA-3′(miR-350-NC)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 H9c2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于含5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 d換成無雙抗的培養(yǎng)基。選用轉(zhuǎn)染試劑FuGene HD將含miR-350及相關(guān)核酸的載體及shRNA-JNK/p38轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞。細(xì)胞分組：對照(Control)組(未處理的H9c2細(xì)胞)；Mutant組(H9c2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-350突變序列過表達(dá)載體)；miR-350組(H9c2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-350過表達(dá)載體)；shRNA-JNK/p38組(H9c2細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA-JNK/p38過表達(dá)載體)；miR-350+anti組(H9c2細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-350和miR-350 antagomir)；血管緊張素(Ang)Ⅱ組(AngⅡ處理H9c2細(xì)胞)。

1.3細(xì)胞表面積的檢測 上述各組細(xì)胞分別于處理后1、3、5、7 d拍照，并應(yīng)用Image J軟件分析細(xì)胞心肌細(xì)胞表面積。

1.4MTT法檢測細(xì)胞相對活力 H9c2細(xì)胞種于96孔板，按上述方法進(jìn)行分組，分別轉(zhuǎn)染2 μg Mock、miR-350和shRNA-JNK/p38質(zhì)粒及給藥AngⅡ(1 mg/ml)1、2、3、4、5 d后，細(xì)胞用胰酶消化重懸，細(xì)胞懸液用0.4%(g/ml)的臺盼藍(lán)等體積稀釋，取10 μl加到細(xì)胞計數(shù)板，靜置3 min，顯微鏡下計數(shù)。細(xì)胞數(shù)/ml=(4大格細(xì)胞總數(shù)/4)×10 000×稀釋倍數(shù)。并用紫外分光光度計測定A540，計算細(xì)胞相對活力百分比。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 H9c2細(xì)胞種于6孔板，分別轉(zhuǎn)染2 μg Mutant、miR-350質(zhì)粒，給藥AngⅡ(1 mg/ml)，于第3天用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化收集，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次(2 000 r/min離心5 min)，收集(1～5)×105細(xì)胞，用500 μl的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-PE對細(xì)胞染色。室溫、避光、靜置5～15 min后；將細(xì)胞懸液混勻；于1 h內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測。

1.6miR-350對細(xì)胞p38和JNK基因表達(dá)影響 用miR-350 antagomir和miR-350共轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，試圖阻滯miR-350的活性，觀察靶基因p38和JNK的表達(dá)變化。細(xì)胞分四組：Control組、miR-350組、miR-350+anti共轉(zhuǎn)染組和shRNA-JNK/p38組。常規(guī)消化收集處理48 h的細(xì)胞，提取總蛋白和總 RNA，分別行Western印跡和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法檢測JNK和MAPK14的蛋白和mRNA表達(dá)。蛋白印跡實驗的膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像并測定光密度值(A值)，以β-肌動球蛋白(actin)為內(nèi)參照，將AJNK/Aβ-actin及AMAPK14/Aβ-actin的比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-350 誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞肥大 與Control組相比，轉(zhuǎn)染第7天，AngⅡ組和shRNA-JNK/p38組細(xì)胞發(fā)生肥大(P<0.05)；miR-350組細(xì)胞肥大顯著(P<0.01)；而miR-350+anti組及Mutant組細(xì)胞未見明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 各組H9c2細(xì)胞加藥處理后不同時間點細(xì)胞相對大小的變化

與Control組比較:1)P<0.05，2)P<0.01;下表同

2.2miR-350 抑制細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染miR-350和shRNA-JNK/p38后1～5 d，細(xì)胞活力呈時間依賴性下降。與Control組相比，轉(zhuǎn)染后3～5 d miR-350組細(xì)胞活性顯著下降(P<0.05)；shRNA-JNK/p38組細(xì)胞活性抑制最為顯著(P<0.01)；而miR-350+anti組、Mutant組及AngⅡ組細(xì)胞活性均未發(fā)生明顯變化(P>0.05)。見表2。

2.3miR-350誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡 心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-350組、shRNA-JNK/p38組、miR-350和miR-350 anti組及AngⅡ組細(xì)胞處理60 h后，各組細(xì)胞通過Annexin V和PI共染色法測定細(xì)胞凋亡情況。Control組細(xì)胞凋亡率為0.06%，miR-350+anti組細(xì)胞凋亡率為0.79%，AngⅡ誘導(dǎo)組細(xì)胞的凋亡率是2.4%，shRNA-JNK/p38組和miR-350組的凋亡率分別是16.36%和8.39%；與Control組相比，miR-350和shRNA-JNK/p38組凋亡率顯著提高(P<0.05,P<0.01)。見圖1。

2.4miR-350 對H9c2細(xì)胞p38和JNK的表達(dá)影響 miR-350的過表達(dá)可在轉(zhuǎn)錄水平抑制內(nèi)源性p38和JNK基因的表達(dá)。而且，miR-350-anti能夠明顯抑制miR-350活性，阻止miR-350對靶基因的影響。與Control組相比，miR-350+anti組細(xì)胞p38和JNK基因和蛋白質(zhì)均無顯著變化。見圖2。

表2 各組H9c2細(xì)胞加藥處理后不同時間點細(xì)胞相對活力

圖1 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

圖2 各組靶基因p38和JNK的表達(dá)水平PCR和Western印跡結(jié)果

3 討 論

本研究前期結(jié)果顯示miR-350通過抑制靶基因p38和JNK的表達(dá)，影響NFATc的轉(zhuǎn)核介導(dǎo)心肌肥大〔9，10〕。研究過程中發(fā)現(xiàn)miR-350抑制H9c2細(xì)胞肥大的同時，細(xì)胞增殖受到抑制，死亡細(xì)胞增多。p38和JNK的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是MAPK通路的一個重要分支，它在細(xì)胞周期、生長、凋亡和細(xì)胞應(yīng)激等多種生理和病理過程中起重要作用〔11〕。細(xì)胞凋亡的增加和心肌肥厚和心衰有關(guān)。

為了從正反兩個方面探索miR-350和凋亡的關(guān)系，將miR-350 antagomir與miR-350過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，抑制miR-350的表達(dá)。結(jié)果如預(yù)期一致，轉(zhuǎn)染miR-350-anti的細(xì)胞miR-350表達(dá)水平受到明顯抑制，而p38和JNK基因表達(dá)水平無變化；從細(xì)胞大小定量分析的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，miR-350-anti明顯改善了miR-350導(dǎo)致的細(xì)胞肥大；并且有效地阻止了miR-350引起的細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果均表明，miR-350誘導(dǎo)心肌細(xì)胞病理性肥大的同時，可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miR-350這種生物學(xué)活性可以有效地被miR-350 antagomir阻滯。

推測miR-350誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡，也是通過抑制靶基因p38和JNK的表達(dá)介導(dǎo)的。miR-350引起心肌細(xì)胞凋亡可能是擴張型心肌病及心力衰竭晚期的一個重要因素，miR-350導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡在調(diào)節(jié)肥厚反應(yīng)和隨后心力衰竭的進(jìn)展中起至關(guān)重要作用。調(diào)控miR表達(dá)可以有效影響心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)程，為心血管疾病的預(yù)測、診斷與治療提供了新的思路。