電針聯(lián)合癌痛貼對(duì)骨癌痛大鼠脊髓背角TLR9及TLR9 mRNA的影響

關(guān)江鋒 王 兵 王 珊 胡作為 楊 航

(武漢市第一醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430022)

骨癌痛(BCP)是大部分惡性腫瘤伴隨的癥狀，還可引發(fā)嚴(yán)重的心理疾患，不利于患者預(yù)后〔1,2〕。電針聯(lián)合癌痛貼用于緩解惡性腫瘤BCP疼痛臨床效果明顯，但其鎮(zhèn)痛機(jī)制尚不明確。Toll樣受體(TLR)9屬于Ⅰ型跨膜受體蛋白，在先天性免疫和獲得性免疫之間發(fā)揮橋梁作用，研究顯示TLR9參與了BCP的發(fā)生與持續(xù)〔3,4〕。本課題擬考察電針聯(lián)用癌痛貼用于大鼠BCP的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1受試大鼠和Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞 雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(體重200～220 g)共80只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2002-2003，所有大鼠自由飲水?dāng)z食。Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞購(gòu)自武漢生物醫(yī)學(xué)工程研究所。

1.2BCP大鼠的制備 采用水合氯醛腹腔注射麻醉，固定在操作臺(tái)，剃凈左側(cè)后肢的毛，消毒脛骨，切開(kāi)脛骨上段，暴露脛骨骨面，用牙鉆在脛骨打孔，用微量注射器向脛骨骨髓腔緩慢注射10 ml含有3×103Walker256傳代大鼠腹水瘤的細(xì)胞懸液，注射后用骨蠟封閉鉆孔處，醫(yī)用酒精沖洗，縫合傷口，青霉素涂抹傷口防感染。

1.3分組和給藥 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(健康大鼠)、模型組、鎮(zhèn)痛貼組和電針聯(lián)合鎮(zhèn)痛貼組，每組20只。鎮(zhèn)痛貼組：實(shí)驗(yàn)前，在大鼠背部對(duì)稱(chēng)兩側(cè)脫毛，面積為3 cm×3 cm，在各大鼠一側(cè)皮膚敷貼癌痛貼，12 h后去除貼劑，連續(xù)給藥12 d，癌痛貼主要由蟾酥、生川烏、蚤休、莪術(shù)、細(xì)辛、乳香和沒(méi)藥配伍制得，由武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室碾成粉末，以一定比例加入基質(zhì)制成藥膏。鎮(zhèn)痛貼組和電針聯(lián)合鎮(zhèn)痛貼組：處理同鎮(zhèn)痛貼組，同期給予電針治療，在安靜環(huán)境下，將大鼠軀干固定在自制固定器上，頭部與四肢均可自由活動(dòng)，將針灸針刺入大鼠左側(cè)“足三里”(ST36)與“昆侖”(BL60)穴，通過(guò)韓氏神經(jīng)刺激儀給予“疏密波”，頻率2/100 Hz，強(qiáng)度以引起大鼠后肢肌肉輕微抖動(dòng)而不嘶叫為宜，隔日給予電針治療，每次30 min，連續(xù)給藥12 d，模型組針灸刺入大鼠學(xué)位后，不通電。

1.4機(jī)械性痛覺(jué)超敏測(cè)定 分別在給藥前、給藥中和給藥結(jié)束測(cè)定大鼠機(jī)械性痛覺(jué)超敏。在安靜環(huán)境中，大鼠適應(yīng)20 min，用一系列規(guī)格的Von Frey 細(xì)絲(0.4、0.6、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 g)按一定順序刺激刺激大鼠左側(cè)足中部，觀(guān)察并記錄大鼠縮足反應(yīng)，每根細(xì)絲的刺激時(shí)間為1～2 s，前后兩次不同刺激間隔10 min，計(jì)算出50%的Von Frey反應(yīng)閾值，作為機(jī)械性痛閾值。

1.5大鼠后肢抓力測(cè)定 分別在給藥第0、6、12天、采用平衡式測(cè)痛儀(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津)測(cè)定大鼠機(jī)械性痛覺(jué)超敏。將大鼠放置于特質(zhì)的有機(jī)玻璃格子內(nèi)，前肢趴在格子的斜面上，雙側(cè)后肢分別踏在兩個(gè)獨(dú)立的傳感器上，待大鼠安靜后開(kāi)始檢測(cè)，檢測(cè)左右側(cè)后肢負(fù)重差值在10 s的計(jì)分，每只大鼠連續(xù)檢測(cè)5次，取均值。

1.6脊髓背角TLR9表達(dá) 大鼠在10%水合氯醛下麻醉，暴露心臟，經(jīng)左心室插管，灌入適量生理鹽水，沖洗干凈血液，灌入4%多聚甲醛250 ml，固定后，取脊髓腰膨大節(jié)段，置于4%多聚甲醛中固定2 h，再分別置于10%、20%和30%蔗糖溶液中，梯度脫水至組織沉淀，OCT包埋，冠狀冰凍切片。

1.6.1RT-PCR檢測(cè)脊髓背角TLR9 mRNA水平 大鼠斷頭，立即在冰浴中取脊髓，將脊髓置于1.5 ml EP管中，每50 mg組織中加入1 ml Trizol試劑，冰浴下勻漿。每1 ml Trizol試劑加入0.2 ml氯仿，震蕩15 s，水浴5 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，取上層水相置于另一個(gè)EP管，加入等體積異丙醇，冰浴15 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，棄上清，加入75%乙醇洗滌，7 500 r/min，4℃離心15 min，棄上清，傾去乙醇，空氣干燥，將干燥后沉淀置于DEPC水中，在紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)OD260和OD280，評(píng)估RNA的純度。以β-actin為內(nèi)參，TLR9上游引物：5′-TTTCCGGCTAGGGAATGGTTCCC -3′，下游引物：5′- TTAAACCAATGAAAGGTAAT 3′，β-actin上游引物：5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′，下游引物：5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAC-3′。逆轉(zhuǎn)錄在0.2 ml無(wú)RNase的PCR管內(nèi)依次加入：70℃變性5 min，冰浴5 min，37℃水浴60 min，95℃水浴5 min，冰浴5 min，得到cDNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：94℃ 5 min，94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 10 min 35個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠影像分析儀成像，分析條帶的吸光度，比較各組條帶與對(duì)照組條帶的灰度比。

1.6.2Western印跡檢測(cè)脊髓背角TLR9水平 大鼠處死后，取脛骨，加裂解液，冰浴勻漿，離心取上清液，取至新的EP管中，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白含量測(cè)定。將大鼠脊柱骨用液氮研磨后加入RIPA置于冰上裂解，并將裂解后的蛋白樣品轉(zhuǎn)移至100℃水浴加熱5 min使蛋白變性。Bio-Rad DC Protein Assay Kit蛋白定量，統(tǒng)一總蛋白上樣量為40 μg。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)蛋白電泳后，轉(zhuǎn)膜，分別加入Anti-TLR9和β-actin 一抗(兔抗鼠)按說(shuō)明書(shū)1∶1 000稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜。加入二抗(1∶5 000稀釋)，電壓15 V，60 min膜的封閉：5%脫脂奶粉/PBST 20 ml，水平搖床，室溫封閉2 h。加ECL-plus發(fā)光顯示液體，曝光，電泳條帶經(jīng)Image J軟件處理，分析各組條帶與對(duì)照組條帶面積。

1.7腫瘤局部組織的炎癥因子含量檢測(cè) 剝離大鼠右后肢，鉆孔取腫瘤組織，以每100 mg加預(yù)冷的500 μl Aim Plex Tissue Lysis緩沖液，勻漿，低溫離心留上清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠不同時(shí)間痛閾值及后肢抓力比較 與對(duì)照組比較，給藥6、12 d后其余各組機(jī)械性痛閾值及后肢抓力均明顯降低(P<0.05)，與模型組比較，鎮(zhèn)痛貼組和電針聯(lián)合鎮(zhèn)痛貼組均明顯增高(P<0.05)，與鎮(zhèn)痛貼組比較，電針聯(lián)合鎮(zhèn)痛貼組均明顯增高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間痛閾值及后肢抓力比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與鎮(zhèn)痛貼組比較：3)P<0.05；下表同

2.2各組大鼠治療后脊髓背角TLR9 mRNA和TLR水平比較 與對(duì)照組(0.7±0.2，0.4±0.1)比較，模型組TLR9 mRNA和TLR水平(1.3±0.3，1.5±0.5)明顯增高(P=0.000)，與模型組比較，鎮(zhèn)痛貼組(0.7±0.3，0.7±0.2)和電針聯(lián)合鎮(zhèn)痛貼組(0.4±0.2，0.3±0.1)均明顯降低(P<0.05)，與鎮(zhèn)痛貼組比較，電鎮(zhèn)聯(lián)合鎮(zhèn)痛貼組均明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

A～D：對(duì)照組、模型組、鎮(zhèn)痛貼組、電針聯(lián)合鎮(zhèn)痛貼組圖1 各組治療后脊髓背角TLR9 mRNA和TLR比較

2.3各組大鼠治療后腫瘤局部組織炎癥因子比較 與對(duì)照組比較，其余各組IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明顯增高(P<0.05)，與模型組比較，鎮(zhèn)痛貼組和電針聯(lián)合鎮(zhèn)痛貼組均明顯降低(P<0.05)，與鎮(zhèn)痛貼組比較，電針聯(lián)合鎮(zhèn)痛貼組均明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組治療后腫瘤局部組織炎癥因子比較

3 討 論

BCP對(duì)應(yīng)中醫(yī)“骨疽”或“骨蝕”的范疇，中醫(yī)認(rèn)為疼痛的發(fā)病機(jī)制在于體內(nèi)氣血淤阻，經(jīng)絡(luò)不通，不通則痛。治療BCP在于活血化瘀和行氣止痛〔5,6〕。癌痛貼方中蟾酥蟾蜍表皮腺體的分泌物，具有攻毒、解毒和止痛的功效；川烏為毛莨科植物烏頭的干燥母根，可祛風(fēng)除濕，溫經(jīng)散寒、祛瘀止痛；蚤休具有消諸瘡，除無(wú)名腫毒及消腫止血的功效；細(xì)辛祛風(fēng)散寒，通竅止痛的功效；莪術(shù)可行氣破血消積止痛，乳香與沒(méi)藥相須為用，共奏活血止痛和消腫生肌的功效。諸藥聯(lián)用具有溫經(jīng)散寒通絡(luò)和解毒活血化瘀的功效，多年來(lái)用于治療和緩解各種惡性腫瘤相關(guān)的癌痛均有明顯效果〔7～10〕。本課題結(jié)果提示癌痛貼有助于改善BCP癥狀。

TLRs屬于高度保守的Ⅰ型跨膜蛋白，在先天性免疫與獲得性免疫間發(fā)揮作用，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)TLRs參與識(shí)別內(nèi)源性組織損傷相關(guān)分子模式，在關(guān)節(jié)炎及腦脊髓炎缺血/再關(guān)注等無(wú)菌性炎癥的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮作用〔11〕。TLR9是TLRs家族中的一員，可識(shí)別內(nèi)源性自身DNA中低甲基化和細(xì)菌/病毒DNA中未甲基化的CpG序列，TLR9不僅在免疫細(xì)胞中表達(dá)，也在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，尤其在小膠質(zhì)及星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，被激活的TLR9可刺激炎性成分細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子大量表達(dá)，引起促炎因子“瀑布”反應(yīng)，引發(fā)疼痛〔12，13〕，另外TLR9的配體能夠增加TRPV1調(diào)節(jié)的鈣離子(Ca2+)內(nèi)流，間接發(fā)揮疼痛調(diào)節(jié)作用。TLR9敲擊的自身免疫性腦脊髓炎小鼠浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞和脫髓鞘病灶均弱于野生型小鼠，進(jìn)一步提示TLR9可能參與了疼痛的產(chǎn)生〔14〕。本課題結(jié)果顯示，TLR9參與了BCP疼痛的發(fā)生與持續(xù)。癌痛貼可顯著降低BCP大鼠脊髓背角TLR9及TLR9 mRNA表達(dá)，與骨癌帖的組成及有效成分密切相關(guān)，如蟾酥所含的有效成分華蟾毒精能夠影響TLRs信號(hào)傳導(dǎo)通路中多種基因的表達(dá)，降低TLR9等多種模式識(shí)別受體相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)NFKBIA等NF-κB抑制蛋白的相關(guān)基因表達(dá)，控制過(guò)度炎癥反應(yīng)〔15〕；含有川烏的舒筋蠲痹湯可通過(guò)抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠血清及病變局部的TLR9表達(dá)〔16〕；莪術(shù)所含的異龍腦和姜黃素可抑制HaCaT細(xì)胞分泌的TLR9和TLR2表達(dá)〔17〕。

中醫(yī)認(rèn)為疼痛緣起于風(fēng)、寒、暑、濕、燥、火或痰濕瘀血等外邪阻滯經(jīng)絡(luò)，導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)不通，加上“風(fēng)、寒、濕三氣雜至合而為痹”，因而不通則痛。BCP所致的疼痛也屬于經(jīng)絡(luò)不通所致的不通則痛范疇，電針可調(diào)和氣血，疏通活絡(luò)，活血止痛，電針對(duì)炎癥痛或神經(jīng)痛等多種急慢性疼痛均有較好的鎮(zhèn)痛作用。本課題選擇“足三里”(ST36)與“昆侖”(BL60)進(jìn)行電針，有助于后肢病理性疼痛，臨床研究顯示患者接受電針時(shí)，當(dāng)發(fā)生“得氣”時(shí)才發(fā)揮作用，即“行針者，貴在得神取氣”，而采用電針治療，與傳統(tǒng)的“捻轉(zhuǎn)提插”的針?lè)?lèi)似，使得針刺部位“得氣”〔18,19〕。

綜上，與單純使用癌痛貼比，癌痛貼聯(lián)用電針用于大鼠BCP的鎮(zhèn)痛作用明顯，鎮(zhèn)痛的可能機(jī)制與降低脊髓背角TLR9及TLR9 mRNA表達(dá)相關(guān)。