沉默ERRα對Bak1、Bcl2腺病毒轉染骨細胞的影響研究

黃佳純，柴爽，黃宏興，汪悅東

(1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫藥大學第三附屬醫院，廣東 廣州 510240)

雌激素對婦女骨骼所具有的重要作用眾所周知，雌激素水平的下降加速了骨質流失并增加了骨質疏松癥發展的可能性[1]。兒童期時雌激素主要作用于骨骺的融合，到了成年期則用于維持骨小梁骨量結構[2]。有研究[3]發現，骨質疏松癥患者的B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl2)表達下降，老年大鼠的Bcl2蛋白水平亦有所降低[4]，骨質疏松癥與性別、年齡相關，其發生與雌激素的缺乏和衰老的關系密切。本實驗前期研究[5]表明，Bcl2基因沉默后MG63細胞存活率降低，而Bak1基因沉默后MG63細胞存活率升高，表明Bcl2/Bak1在調控MG63細胞凋亡平衡當中發揮重要作用，Bcl2基因沉默后MG63細胞堿性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP)表達降低，而Bak基因沉默的MG63細胞ALP表達增強，說明Bcl2/Bak在調節成骨活動中起到了重要作用。本文在此基礎上，進一步探討雌激素相關受體α(estrogen-related receptor alpha，ERRɑ)與Bcl2家族蛋白對骨質疏松癥的作用影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和儀器 人成骨肉瘤細胞(MG63)由中國科學院上海細胞所細胞庫提供，Opti-MEM培養基、胎牛血清、DMEM培養基、Pen/Strep從Gibco公司購買；Bak1(D4E4) Rabbit mAb、Bcl2(50E3) Rabbit mAb、ERRɑ(E1G1J) Rabbit mAb均自CST公司購入；HRP-Goat Anti-Mouse IgG、HRP-Goat Anti-Rabbit IgG均從Jackson公司購入；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、Lipofectamine 2000、TRIzol Reagent、One Shot?Stbl3TM E.coli感受態細胞、bP Clonase Ⅱ enzyme mix、LR Clonase Ⅱ enzyme mix、Taq DNA聚合酶均購自Invitorgen公司；Age Ⅰ、EcoR Ⅰ、Pac Ⅰ、T4 DNA連接酶購自NEb公司；MTT、RIPA細胞裂解液、EGTA均購自Sigma公司；DMSO購自廣州化學試劑廠；Calcium Indicators購自Molcular Probes公司；蛋白酶抑制劑/磷酸化抑制劑均于Merck公司購買；抗骨形態發生蛋白4(bone morphogenetic protein-4，BMP-4)抗體、抗骨橋蛋白(osteopontin，OPN)抗體、抗Runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)抗體、抗腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-ɑ)抗體于abcam公司購入；抗結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)抗體購自Santa公司；膠回收/純化試劑盒、質粒提取試劑盒均購自北京天根生物有限公司；DH5ɑ感受態細胞購自北京鼎國生物有限公司；蛋白酶K購自上海碧云天生物有限公司；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇等均為國產分析純試劑。超凈工作臺(SW-CJ-1FD 中國江蘇蘇凈)；細胞培養箱(DHP-9052 中國上海-恒)；電泳儀、電轉儀、蛋白轉印儀、凝膠成像系統(伯樂)；普通PCR儀(TCS 中國博日)；熒光定量PCR儀(AbI 7500 美國Thermo)；酶標儀(美國Thermo)；倒置熒光顯微鏡(IX73 美國OLYMPUS)；微孔板震蕩器(Scientific industries)；高速低溫離心機(beckMan-22R)；微量核酸定量儀(Thermo NanoDrop)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和總RNA提取 MG63細胞以1×106細胞/mL接種于T75，于5% CO2、飽和濕度下在DMEM高糖培養基中培養。待長至約80%融合時消化、收集細胞，傳代。舍棄舊培養基，以預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌細胞3次，盡可能吸盡液體后加入1 mLTrizol破碎溶解細胞，提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。

1.2.2 目的基因沉默重組腺病毒載體構建 ERRɑ沉默重組腺病毒載體(Ad-shERRɑ)構建：經逆轉錄反應、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增目的基因、重組質粒構建、同源重組構建重組腺病毒質粒、重組腺病毒顆粒的包裝、重組腺病毒滴度測定、重組腺病毒感染MG63細胞，實時熒光定量核酸擴增檢測系統(real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)檢測Ad-shERRɑ重組腺病毒感染MG63后ERRɑ的表達以確定ERRɑ沉默重組腺病毒載體構建成功。

Bak1及Bcl2沉默重組腺病毒載體(Ad-shBak1、Ad-shBcl2)構建：構建shRNA腺病毒載體并用其轉染MG63細胞，篩選出shRNA腺病毒載體沉默效率最好的進行逆轉錄反應及定量PCR反應，通過Western blot檢測shRNA腺病毒質粒沉默效率后進行腺病毒包裝。

1.2.3 細胞轉染 MG63細胞培養24 h后，感染空載病毒組命名為NC對照組，感染Bak1和ERRɑ沉默重組腺病毒命名為Ad-shERRɑ+Ad-shBak1組，感染Bcl2和ERRɑ沉默重組腺病毒命名為Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2組，同時感染Bak1、Bcl2和ERRɑ沉默重組腺病毒命名為Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2組四組，感染復數(MOI)為50。重組腺病毒感染48h后，分別消化收集細胞，qPCR、Western blot檢測ERRɑ、Bcl2、Bak1在MG63細胞中的表達，以確定過表達重組腺病毒感染MG63后ERRɑ、Bcl2、Bak1基因發生轉錄。qPCR實驗結果利用AbI7500公司自帶的PCR系統軟件分析，觀察擴增曲線，分別計算出各組樣本的結果并進行組間比較。

1.2.4 細胞增殖、ALP活性、鈣離子濃度檢測 MG63細胞感染重組腺病毒48h后，棄舊培養基，消化收集細胞，分別采用MTT法檢測MG63細胞增殖，用酶標儀490 nm測定光密度值(OD)。ALP活性的測定：MG63細胞感染重組腺病毒48 h后，收集對數期MG63細胞制成細胞懸液，每孔加入2 mL細胞懸液后置于37℃，5% CO2，飽和濕度條件下培養24 h，于冰上放置考馬斯亮藍蛋白定量后測定ALP活性。細胞鈣離子濃度的檢測：消化、收集細胞，PBS洗滌3次。取細胞懸液，加入Calcium Orange Indicator，置細胞培養箱中孵育1 h上機，加入10% Triton 100后再加入CaCl2，吹打均勻，避光孵育10 min，測定熒光值。

1.2.5 骨調節蛋白BMP-4、CTGF、OPN、Runx2、TNF-ɑ檢測 MG63細胞感染重組腺病毒48 h后，舍棄舊培養基，消化收集細胞，離心，提取總蛋白，樣品蛋白處理后測定蛋白濃度，上樣、電泳、轉膜，封閉，一抗4℃孵育過夜后在室溫下洗滌3次，室溫下二抗孵育后洗滌3次，將膜蛋白放入暗匣中曝光進行顯影和定影，化學發光顯色后使用Image J軟件處理系統分析各組目標蛋白帶的光密度值進行圖像分析。

2 結 果

2.1 Ad-shERRɑ、Ad-shBak1、Ad-shBcl2對各組MG63細胞增殖、ALP活性、鈣離子濃度的影響結果(見表1，見圖1) 與NC對照組比較，(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1)組細胞活性、ALP活性明顯升高，鈣離子濃度明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)組細胞活性、ALP活性均降低，鈣離子濃度明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)組的鈣離子濃度降低(P<0.01)，細胞活性、ALP活性亦下降，但差異不明顯(P>0.05)。與(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1)組比較，(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)組與(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)組細胞活性、ALP活性明顯下降，鈣離子濃度明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)組比較，(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)組的細胞活性、鈣離子濃度降低，差異有統計學意義(P<0.01)，ALP活性稍升高但差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 Ad-shERRɑ干預Bak1、Bcl2重組腺病毒轉染的各組MG63細胞中骨調節蛋白的影響結果(見表2，見圖2～3) 與NC對照組比較，(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1)組BMP-4、TNF-ɑ均降低，而CTGF、OPN、Runx2均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)組BMP-4、CTGF、OPN、Runx2均降低，而TNF-ɑ升高，差異有統計學意義(P<0.01)；(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)組BMP-4、CTGF、OPN、Runx2、TNF-ɑ均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1)組比較，(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)組和(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)組CTGF、OPN、Runx2和(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)組BMP-4、TNF-ɑ均降低，而(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)組TNF-ɑ升高，差異有統計學意義(P<0.01)，(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)組BMP-4雖亦降低但差異無統計學意義(P>0.05)；與(Ad-shERRɑ+Ad-shBcl2)組比較，(Ad-shERRɑ+Ad-shBak1+shBcl2)組BMP-4、CTGF、OPN均升高，而TNF-ɑ降低，差異有統計學意義(P<0.01)，Runx2基本持平，差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

雌激素相關受體ERR分α、β、γ3種亞型，迄今仍未發現其相應配體，其中對ERRα在腫瘤、冠心病、糖尿病等疾病中的功能作用研究受到較大的關注[6]。雌激素相關受體ERR和雌激素受體ER的序列在DNA結合域上相似度高達68%，在配體結合E域等蛋白的其他部分僅36%的相似度，這也許是ERRα不能與雌激素結合的原因之一[7-8]，但不少數據均強調了ERRα在調節骨代謝中的重要地位[9]，Shoukry等[10]以200例絕經后骨質疏松癥婦女和180例健康且年齡匹配的絕經后婦女作對照，通過AluI的PCR片段長度多態性，證明了ER-b AluI G/A和ERRa 23-重復多態性與骨密度(bone mineral density，BMD)的關聯，說明了ER-b和ERRa多態性可能對sRANKL水平產生影響。Huang等[11]的研究也表明了ERRα/Gls信號通路在MSCs成骨分化中發揮重要作用。近些年來，ERRα在絕經后骨質疏松發生發展中的地位逐步被提高，其有望成為防治骨質疏松癥的新靶點[12]。

B細胞淋巴瘤2家族蛋白介導內源性凋亡通路[13]，根據家族內各蛋白的功能和結構可將其分成三個主要亞家族：4指Ad-shBcl2+Ad-shBak1組抗凋亡BCL2蛋白(BCL2，MCL1，BCLxL，BCLW，BFL1)，促凋亡效應因子(BAK，BAX，BOK)和促凋亡蛋白BH3[14]，BCL2家族成員不僅能調控線粒體的凋亡，還能通過對Ca2+信號的調節而誘導細胞凋亡[15-16]。Song等人[3]發現與年輕大鼠相比，老年大鼠Bcl2蛋白水平降低了20%，并且老年大鼠的Bax蛋白水平比年輕大鼠高11%。國內劉嘉眉等[4]檢測絕經后婦女患者髖關節置換手術中取下股骨頭或股骨頸中松質骨成骨細胞中Caspase蛋白和Bcl2蛋白，發現骨質疏松癥組中Bcl2表達下降，即骨質疏松癥組中細胞凋亡情況較對照組嚴重。國內外的研究均表明，衰老或患骨質疏松癥都會降低Bcl2的表達量。

表1 Ad-shERRɑ干預Bak1、Bcl2重組腺病毒轉染的各組MG63細胞增殖、ALP、鈣離子濃度影響±s)

表2 Ad-shERRɑ干預Bak1、Bcl2重組腺病毒轉染的各組MG63細胞中骨調節蛋白的影響±s，c/(μmol·L-1)]

圖1 各組MG63細胞增殖、ALP活性、鈣離子濃度檢測結果(GraphPad prism 5)

注：1指NC對照組；2指Ad-shBcl2組；3指Ad-shBak1組；

圖2 各組MG63細胞中(BMP-4、CTGF、OPN、Runx2、TNF-ɑ)蛋白灰度分析(凝膠電泳法)

圖3 各組MG63細胞中BMP-4、CTGF、OPN、Runx2、TNF-ɑ檢測結果

骨形態發生蛋白的表達對于骨骼的發育重塑至關重要[17]，有研究[18]表明，BMP4可促進骨組織愈合時的血管生成和骨的再生，還可誘導間充質干細胞向成熟的軟骨細胞分化，增多軟骨的細胞外基質，有助于骨和軟骨組織的修復[19]。結締組織生長因子是一種細胞外基質分泌蛋白，可促進體外培養的破骨細胞前體細胞增殖，促進其分化為成熟多核破骨細胞，使破骨細胞的骨吸收功能被激活[20]，Hendesi等[21]實驗說明，CTGF通過αvβ1整合素增強成骨細胞黏附，通過對細胞骨架的重組和Rac1的激活促進成骨細胞分化。骨橋蛋白可參與各種生物活動包括基質重組和組織鈣化，產生各種促炎細胞因子和趨化因子，以及抑制細胞凋亡活動，在骨的形態發生和重塑上起著重要作用[22]。有體外實驗[23]表明，Runx2在未成熟成骨細胞達到了最高的表達水平，而在成骨細胞成熟時表達減少了。體內實驗[24]說明，Runx2基因敲除的小鼠骨形成減少而導致骨質下降。腫瘤壞死因子α是一種強大的破骨細胞激活因子，是骨代謝和骨重塑的重要調節因子，可以刺激破骨細胞的分化，屬于骨吸收因子。TNF-α可降低成骨細胞分化的特殊標志物，還可以調控BMP-2的表達，可抑制成骨細胞的分化[25]。Liao等[26]實驗證明，TNF-α誘導的細胞氧化應激是通過增加活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的合成速率和降低ROS的消除速率來實現的。綜上所述，BMP-4、CTGF、OPN、Runx2、TNF-α蛋白的表達均與成骨細胞的增殖分化息息相關。

本實驗前期研究表明[5]，沉默Bak1基因后MG63細胞細胞活性升高，成骨活動增加，細胞內鈣離子濃度降低，沉默Bcl2基因后MG63細胞細胞活性降低，成骨活動減少，鈣離子濃度升高，而Bak1+Bcl2聯合沉默組與對照組在各觀察指標上差異無統計學意義。本實驗研究中用沉默Bak1、Bcl2腺病毒載體轉染MG63細胞，再用沉默ERRα進行干預，進一步研究不同組別MG63細胞的增殖、ALP活性、鈣離子濃度和相關蛋白的情況。實驗結果表明，沉默ERRα的干預能提高Bak1沉默腺病毒轉染MG63細胞活性，降低細胞鈣離子濃度，促進BMP4、CTGF、OPN、Runx2等蛋白的表達和抑制TNF-α的表達，且能降低Bcl2沉默腺病毒轉染MG63細胞活性，升高細胞鈣離子濃度，抑制BMP4、CTGF、OPN、Runx2等蛋白的表達和促進TNF-α的表達；而對于被沉默Bak1、Bcl2同時轉染的MG63細胞，其細胞鈣離子濃度和蛋白表達量均降低，對細胞活性的影響不明顯。BMP4、CTGF、OPN、Runx2為促成骨蛋白，TNF-α可削弱成骨分化，結合本實驗及前期研究[5]可說明，ERRα的沉默可能間接減弱了雌激素對成骨的作用，進一步強調了雌激素相關受體在骨代謝中的地位。

2014 年美國國家骨質疏松癥基金會的預防和治療骨質疏松癥臨床醫生指南[27]認為，人體99%的鈣儲量在骨骼中，當外源性鈣供應不足時，骨組織從骨骼吸收出鈣，釋放到血液，以保持血清鈣水平的恒定。胞內高濃度的Ca2+可激活Ca2+依賴性酶，使DNA發生斷裂，細胞骨架破壞，最終誘導細胞凋亡[28]。絕經后的雌激素水平急速下降，使破骨細胞形成和成骨細胞凋亡的速度加快，從而導致骨流失[29]，骨是Ca2+的重要儲存場所，當骨量下降，Ca2+濃度升高，加速了骨細胞的凋亡，二者之間的相互作用或許是骨質疏松癥發生的關鍵。Bcl2蛋白是鈣信號的主要抑制因子之一[15-16]，因此，ERRα和Bcl2基因與胞內Ca2+濃度間的關系是值得探討的。

總之，此次研究證實了沉默ERRα對沉默Bak1、Bcl2腺病毒載體轉染的MG63細胞增殖分化具有影響，這為診治骨質疏松提供了新的思路。然而本實驗存在一定局限，沒能更深入探討其具體作用方式，故需在此基礎上對ERRα、Bak1、Bcl2三者間共同作用及與其他信號通路的聯系進行進一步的研究和探討。