瀘型酒發酵過程中酵母菌演替規律及其對部分風味分子形成的影響

楊建剛，蘇 暢，竇 曉，郭家秀，張 琦，張宿義，敖宗華，沈才洪

（1.四川理工學院生物工程學院，四川 自貢 643000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000）

不同國家有不同種類的著名酒精飲料，如蒸餾酒中的威士忌酒、白蘭地、杜松子酒、朗姆酒、伏特加和中國白酒及釀造酒中的德國啤酒、法國葡萄酒和日本清酒[1]。與其他蒸餾酒相比，中國白酒的乙醇體積分數通常為40%～55%[2]，基于風味特征，中國白酒可分為清香型、濃香型、醬香型、米香型、藥香型等12 種風味。瀘型酒為濃香型白酒，而瀘州老窖大曲酒是濃香型白酒的典型代表，其獨特的原窖工藝分層堆糟法（圖1）造就了瀘型大曲獨特的風味與口感。瀘型酒的生產以高粱為主要原料，以大曲為糖化發酵劑，采用泥窖進行多菌種混合循環固態發酵。通過分離培養和分子生物學手段，發現窖池中存在的微生物主要包括酵母、霉菌、細菌、古菌，并呈現出極高的多樣性[3-4]。酵母菌作為白酒發酵過程中必不可少的微生物之一，對白酒的形成有著不可或缺的作用。傳統的酵母菌株鑒定方法建立在菌株的形態、生理特性和生物化學特性質差異之上。然而這些特征會受培養條件的影響，在某種程度上具有不確定性，為確保鑒定結果的可靠性，鑒定1株菌經常需要完成50～100 項實驗[5]，費時費力且重復性不高。近年來，以核酸為研究對象的分子生物學技術以其簡便、準確等優點逐漸被應用到酵母菌的分類鑒定中。

圖1 原窖法瀘型酒的發酵工藝Fig. 1 Fermentation process of Luzhou-flavor liquor

濃香型白酒窖池中化學物質的生化代謝和窖池中存在的微生物彼此聯系、互相促進、互相制約、協調發展共同構成了窖池特定的微生物生態系統。發酵酒醅在窖池環境中充當著物質循環、能量流動和信息傳遞的“三流運轉”規律的載體。環境信息通過酒醅發酵過程的傳遞，調控著窖池微生物種類的變化和代謝產物的生成和積累，決定著窖池物質代謝和能量代謝的走向。窖池在連續投入生產的過程中，每一個輪次，就是窖池環境中微生物區系和環境的一次動態發展和平衡的過程。在這個動態發展和平衡生態體系中任何一個因素的異常變化，都必將引起窖池中其他因素不同程度的異常變化及反饋作用，最終導致窖池中代謝產物成分和比例的變化，從而影響濃香型白酒的品質和風格[6-8]。

本研究通過對不同時期酒醅中分離酵母菌的26S rRNA D1/D2區序列進行分析，應用局部序列比對基本檢索工具BLAST，在基因序列數據（GenBank）中進行同源序列搜索，比較供試菌株與已知酵母菌相應序列的同源性。對分離的130余株酵母菌的26S rRNA D1/D2區進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，對擴增產物進行單鏈構象多態性（single strand conformation polymorphism，SSCP）分析和序列測定分析，并對酒醅不同發酵時期的風味物質進行測定，探究酒醅發酵過程酵母的演替規律及風味物質的形成規律。對兩者之間的內在因果關系進行歸納與總結。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

對瀘州老窖龍泉窖發酵0、4、8、12、20、30、44 d的酒醅進行采集。樣品的采集時間點是參照Yan Shoubao等[9]的研究確定的。

Taq PCR Master Mix、引物NL1和NL4 北京博邁德生物技術有限公司；氫氧化鈉、酚酞、無水乙醇（均為分析純） 重慶川東化工（集團）有限公司；氯化鈉（分析純，純度＞99.5%）、乙醚（色譜純）、無水乙醇（分析純，純度＞99.9%） 成都市科龍化工試劑廠；4-辛醇（CAS編號589-62-8，純度＞97%） 梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；干燥器（變色硅膠作干燥劑） 蘇州龍輝干燥劑有限公司；實驗用水均為超純水由本實驗室自制；4-辛醇溶液（3.09 g/L）：準確稱取0.030 9 g 4-辛醇與盛有少量色譜級甲醇的10 mL容量瓶中，用色譜級甲醇定容，混勻放置4 ℃冰箱避光保存。

1.2 儀器與設備

GT9612基因擴增儀 杭州柏恒科技有限公司；CF15R離心機 日立集團；JK600C電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司；Innotech凝膠成像系統 美國Alpha公司；6890 GC-5975 MS氣相色譜-質譜聯用儀、色譜柱DB-WAX（60 m×250 μm，0.25 μm）、1 μL進樣針、HP-1色譜柱（50 m×0.2 mm，0.5 μm） 美國Agilent公司；SPME手動進樣手柄 上海安譜科學儀器有限公司；萃取頭50/30UM DVB/CAR on PDMS 美國Supelco公司；DHG-9123A電熱干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；DT1002A 0.1 mg電子天平 常熟市桂衡天平儀器有限公司；DL-1電子萬用爐 北京市永光明醫療儀器有限公司；蒸餾裝置、25 mL或50 mL堿式滴定管 天長市旭立玻璃儀器有限公司；OP TOP電子天平（精確度0.01 g） 舜宇恒平儀器廠；EDI touch-S10超純水機 上海和泰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌分離

在瀘州老窖龍泉窖中采取第0、4、8、12、20、30、44天的酒醅，每個時期的酒醅振蕩混勻后取50 g加入450 mL無菌水里面充分混勻后，吸取1 mL混合液到裝有9 mL無菌水的試管中，依次做成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6五個梯度，然后再用YPD培養基（酵母粉10 g，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH值）和PDA培養基（馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH值）進行平板分離。

1.3.2 PCR擴增和測序

1.3.2.1 總DNA提取

在涂布的平板上挑取單菌落再劃線純化，分離純的酵母菌株。用Makimura等[10]方法提取菌體總DNA 。

1.3.2.2 PCR擴增26S rRNA D1/D2區

PCR擴增反應正向引物NL1：5’-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3’，反向引物NL4：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’，PCR采用25 μL體系，擴增反應條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循環36 次；72 ℃ 8 min[11]。

1.3.2.3 PCR產物的瓊脂糖電泳檢測

取2 μL PCR擴增原液點樣于1%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化已錠染色后在紫外燈照射下確定是否擴出所要片段。26S D1/D2區擴增出單一明亮條帶，片段大小約為500～600 bp。

1.3.3 DNA序列分析方法

1.3.3.1 DNA序列分析

用DNA Star軟件并結合DNA正反向序列圖譜對DNA序列進行拼接和校正。將校正后的序列在國際核酸數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中進行同源序列搜索，初步確定受試菌株的分類地位。在D1/D2區可以按如下經驗值判斷：1）與最近緣種的模式菌株相似率為100%，可確定為同一種；2）與最近緣種的模式菌株的相似率小于98%，可初步確定為新種；3）與最近緣種的模式菌株的相似率在99%～100%之間，它們的關系要視不同的情況而定，除考慮序列差異外，還應考慮生理生化性狀差異[11]。

1.3.3.2 SSCP分析

用DCodeTM突變檢測電泳儀進行SSCP檢測。根據使用說明配制丙稀酰胺-甲叉雙丙稀酰胺（質量比37.5∶1）的8%凝膠。采用李娟等[11]的方法，即把PCR產物稀釋2～5 倍，取5 μL（大約150～300 ng）與等量的上樣緩沖液（0.05%溴酚蘭，0.05%二甲苯青，95%甲酰胺，4% 0.5 mol/L EDTA溶液，pH 8.0）混勻，在95 ℃變性10 min，迅速放在冰上，放置15 min。把變性后的樣品依次加入到點樣孔中，200 V電壓10 ℃電泳16 h。電泳結束后將凝膠按照Wallace[12]的方法進行硝酸銀染色，用相機拍照保存。

1.3.4 酒醅主要風味物質測定

1.3.4.1 待測樣品前處理

稱取25 g糟醅混合，加入體積分數73%的乙醇溶液50 mL，常壓蒸餾，取餾出液25 mL，將樣品送到中國瀘型酒質量控制研究中心檢測。

1.3.4.2 色譜條件

進樣口溫度：250 ℃；氫火焰離子化檢測器溫度：250 ℃；進樣體積：1 μL；程序升溫：35 ℃保持5 min，然后以5 ℃/min速率升溫到95 ℃，再以10 ℃/min速率升到200 ℃，保持15 min，總運行時間42.5 min[13]。

1.3.5 酒醅乙醇含量測定

稱取25 g糟醅，加入飽和氯化鈉溶液50 mL，常壓蒸餾，接取餾出液25 mL，取5 mL餾出液，加入2 mL乙醚進行萃取，取有機相加入10 μL 3.09 g/L的4-辛醇，進行氣相色譜-質譜半定量分析。

色譜條件：DB-Wax毛細管柱，柱長30 m，內徑0.32 mm，液膜厚度0.25 μm；載氣He，流速2 mL/min，不分流；柱溫：進樣口溫度保持在250 ℃，起始氣相色譜柱溫在40 ℃維持4 min，之后3.5 ℃/min升溫到50 ℃，再以6 ℃/min升溫到80 ℃，然后以8 ℃/min升到220 ℃，最后以10 ℃/min升到230 ℃，維持9 min，共計38.667 min。質譜條件：離子源溫度200 ℃；接口溫度250 ℃；電離方式：電子電離正離子模式；電子能量70 eV；掃描質量范圍m/z 33～450；溶劑延遲時間2.3 min。定性與半定量分析：在NIST11譜庫中檢索出匹配度大于800的化合物，采用內標進行定量，根據4-辛醇與風味物質峰面積之比計算出揮發性風味物質含量，再乘以稀釋倍數得出樣品中揮發性風味物質的含量，每個樣品測定3 次取平均值[14]。

2 結果與分析

2.1 26S rRNA D1/D2區序列的擴增

圖2 部分26S rRNA D1/D2區序列PCR擴增產物電泳圖Fig. 2 Electrophoresis of PCR amplified products of partial sequence of the D1/D2 region of the 26S rRNA D1/D2 gene

對分離的130 株菌的26S rRNA D1/D2區序列進行PCR擴增，圖2為PCR擴增產物電泳圖，顯示產物的長度都在500～750 bp之間，這與酵母菌的D1/D2區域序列長度為500～600 bp左右相符合，說明擴增正常。

2.2 對不同種菌株的26S rRNA D1/D2 SSCP圖譜比較

為降低測序成本，對分離出的130 株酵母菌首先進行26S rRNA D1/D2 SSCP圖譜比較，通過比較可以找出不屬于同一種類的酵母菌。由圖3可以看出，不同株菌的條帶差異很明顯。

圖3 菌株間的26S rRNA D1/D2 SSCP圖譜比較Fig. 3 Comparison of 26S rRNA D1/D2 SSCP patterns between strains

2.3 26S rRNA D1/D2區序列的比對

表1 不同種菌株26S rRNA D1/D2區與模式菌株比對結果Table 1 Comparison of 26S rRNA D1/D2 region of different strains with model strains

通過在GenBank數據庫中，對分離的130 株菌的26S rRNA D1/D2區序列進行同源序列搜索（BLAST）后，將相似度大于99%鑒定為同一種，98%～99%的鑒定為同一屬，小于98%的初步鑒定為新種，結果如表1所示。有126 株鑒定到15 種，它們分屬于P. fermentans、N. castellii、T. delbrueckii、S. cerevisiae、P. membranifaciens、C. humilis、K.exigua、Saccharomycopsis fibuligera、M. farinosa、C.cabralensis、P. kudriavzevii、C. ethanolica、P. occidentalis和Zygosaccharomyces bailii。另外4 株相似度小于98%，初步認為可能是新種，需進一步確定。

2.4 基于26S rRNA D1/D2 區序列構建M-L系統樹

圖4 基于26S rRNA D1/D2區序列構建的M-L系統樹Fig. 4 M-L system tree based on 26S rRNA D1/D2 region sequence

用軟件MEGA 6.06對所有序列進行比對后，刪除兩端未對齊的堿基生成進化樹，并進行1 000 次的Bootstraps檢驗。采用“Maximum Likelihood Tree”方法顯示進化樹，其中ban2-A2-LB10-2-X0-2菌株為外群，如圖4所示，對酒醅中分離出的15 種類型的酵母菌的種間親緣關系進行了界定,可以發現分離出的菌株中的優勢菌株為：C. rugopelliculosa、P. fermentans、S. cerevisiae、P. membranifaciens、C. humilis、S. fibuligera、C. cabralensis、P. kudriavzevii、C. ethanolica、P. occidentalis。

2.5 酒醅不同發酵時期各類型酵母菌數量的聚類分析

對不同發酵時期分離的酵母菌的26S rRNA D1/D2區序列比對鑒定后，結合前期平板計數的統計結果分析，從圖5可以直觀看出，在酒醅發酵的各時期占優勢地位的酵母菌。第0天占主體地位的酵母菌為C. rugopelliculosa、P. fermentans、N. castellii、T. delbrueckii和S. cerevisiae；第4天酵母數量很豐富、其中占優勢的酵母菌為N. castellii、T. delbrueckii、S. cerevisiae和P. membranifaciens；第8天酵母菌數量仍然很多，但種類有所減少，主要以S. cerevisiae、C. humilis和K. exigua為主；第12天隨著窖內環境的變化，酵母菌的數量和種類都有所下降，這時期窖內的酵母菌以N. castellii和S. cerevisiae為主體；到20～30 d，隨著窖內酸度和乙醇含量的上升，使得釀酒酵母成為窖池內的主體菌株，第44天，這時期發酵結束，可以看出窖內的酵母菌數量很少，種類趨于多樣化，其中C. ethanolica的出現很有可能與窖內乙醇含量的升高有關。

圖5 酒醅不同發酵時期各類型酵母菌的數量聚類熱圖Fig. 5 Quantitative clustering chart of various species of yeasts in fermented grains at different fermentation times

2.6 酒醅不同發酵時期風味物質分析

對不同時期濃香型白酒酒醅中主要的四大酯演變規律進行定量分析，結果如圖6所示，四大酯含量變化趨勢基本保持一致。在0～12 d，窖池內酵母的種類較為豐富，C. rugopelliculosa、P. fermentans、N. castellii、T. delbrueckii、S. cerevisiae和P. membranifaciens在酒醅酵母占據主導地位，剛開始發酵期間由于窖池中環境較為優越，四大酯類呈迅速上升趨勢（圖6）。而在0～12 d，如圖7所示，酒醅中乙醇含量也呈上升趨勢，推測酯類上升跟乙醇上升有著一定的關聯，產酯酵母對乙醇親和力很強，以乙醇作碳源能發育很好，而且又有較強的氧化特性。乙醇能增進產酯酵母的呼吸作用，與酯發酵之間存在特殊關聯，產酯酵母具有一定的乙醇發酵力又具備醋酸發酵的能力。酯發酵組成中的羰基來自乙醇的氧化生成物，即產酯酵母必須具有氧化乙醇的能力[15]。在12～20 d，大多數酯類呈下降趨勢，乙醇含量也呈下降趨勢，這可能與窖池的溫度相關，在酒醅發酵第12天，由于酒醅細菌數量迅速增加，導致窖池環境達到一個頂溫[16]，有很多學者對產酯酵母產酯條件進行過研究，其研究結果大致相同：產酯酵母通常在19～30 ℃的溫度范圍內均能產酯，但最適產酯溫度為25～30 ℃；培養溫度升至37 ℃以上時，產酯量則急劇下降，甚至不產酯；而對于少數酵母，如球擬酵母在35 ℃培養時，能保持最高的產酯量，但產酯能力也相對較弱[17]。圖5也能反映在12～20 d酵母數量呈下降趨勢，不論是酵母數量還是產酯條件，都不利于酒醅中酯類物質的生成。在20～30 d己酸乙酯、乳酸乙酯呈上升趨勢，其中乳酸乙酯呈明顯上升這可能是由于窖池中乳酸菌一直是在細菌里面占據主導地位[18-19]。其次，到了發酵后期，營養物質的消耗可能導致乳酸菌產生大量的乳酸，乳酸作為底物被酵母利用而生成更多的乳酸乙酯，而己酸乙酯在20～30 d內呈明顯上升，這可能由于窖池中氧氣被消耗，其他菌的數量呈下降趨勢，己酸菌作為厭氧菌，可以與酒曲發酵產生的乙醇發生酯化反應，生成濃香型白酒的所特有的主體香成分己酸乙酯[20]，這一過程也能從乙醇含量的減少反映。在第44天以后乳酸乙酯、乙酸乙酯呈上升趨勢，酵母菌中種群豐度較大，但相對數量較少，造成乳酸乙酯、乙酸乙酯含量上升可能是多種酵母與乳酸菌之間多微共酵，不少報道證實了乳酸菌、醋酸菌與酵母協同發酵會產生比單菌發酵更多的風味相關物質[21-24]。而其余兩大酯含量均呈下降趨勢，這是窖池環境中營養物質的消耗導致相關微生物數量下降導致。

圖6 酒醅不同發酵時期主要酯類變化曲線Fig. 6 Change in major ester contents in fermented grains during fermentation

圖7 酒醅不同發酵時期乙醇含量變化曲線Fig. 7 Change in ethanol content in fermented grains during fermentation

3 討 論

本研究首先通過傳統分離方法，對瀘型酒發酵過程不同時期酒醅中的酵母菌進行了分離，得到了130 株酵母菌，進一步應用26S rRNA D1/D2區序列分析法，對將其中126 株鑒定為15 個不同種的酵母。其次，對影響瀘型酒酒質的四大酯類進行跟蹤探究，發現在0～12 d發酵期間主要呈上升趨勢，推測可能剛開始發酵階段，窖池環境相對其他時間段優越，酵母的數量和種類都比較豐富，有利于產酯酵母如C. rugopelliculosa、P. fermentans、N. castellii、T. delbrueckii、S. cerevisiae和P. membranifaciens產酯。而在12～20 d四大主體相關風味物質基本呈下降趨勢，這可能是頂溫區后，除了部分耐熱細菌還能存活，大多數酵母因不能耐受高溫而導致數量減少，影響了風味物質的生成。在20～30 d乳酸乙酯、己酸乙酯呈上升趨勢，這可能與微生物在發酵過程前期，己酸菌及其他細菌分解、利用葡萄糖和淀粉等糖類物質產生大量己酸和乳酸，導致己酸乙酯和乳酸乙酯呈上升趨勢。44 d后丁酸乙酯和己酸乙酯下降可能與惡劣的環境導致與其相關微生物數量下降有直接關系。

目前對于白酒相關微生物的研究方法已有很多，例如DGGE和高通量等方法。Zhang Liqiang等[25]運用PCR-DGGE技術解析了不同類型大曲中微生物的組成差異；Zheng Qi等[26]運用高通量測序技術對30 a窖齡和300 a窖齡的瀘州老窖窖泥微生物的多樣性進行了系統分析。這些技術與傳統的分離鑒定方法存在著很大的優勢，可以簡單直觀地反映出某一時期某種物質中可培養以及不可培養微生物的組成，但傳統分離也存在著自身獨有的優勢，相比較現代分子生物學技術它可以得到活的菌株，為微生物的進一步研究提供基礎。本實驗雖然對不同時期酒醅中分離的酵母菌的26S rRNA D1/D2區序列進行分析，取得了一定的效果，但是自然界中微生物的多樣性非常復雜[27]，絕大多數微生物不能通過傳統純培養的方法在培養皿上進行培養和分離，研究顯示，只有1%～5%的微生物可以在實驗室實現純培養[28]。再者，基于rRNA基因片段或ITS區域高通量測序的微生物多樣性分析一方面只能依賴于基因庫中已知基因序列做出推斷，另一方面由于核糖體RNA基因片段的保守性較高，許多未知微生物往往只能鑒定到所在屬，因而只能在門、綱、目、科、屬這些級別進行微生物群落進化和種屬親緣關系分析；同時由于缺乏功能基因的具體信息，使進一步深入研究面臨瓶頸[29]。

近年來，隨著分子生物學50余年突飛猛進式的發展，“組學時代”的序幕已經拉開，在食品行業，宏基因組、宏轉錄組也開始發揮它們的作用[30-32]，用于探索各種微生物在發酵過程中的代謝途徑、揭示它們特定的功能和對風味的貢獻。因此要明確目標風味成分的消長規律與酵母演替規律及其代謝特性之間的內在因果關系，需要借助宏基因組與宏轉錄組技術，為進一步研究傳統中國白酒發酵機理提供一定理論依據。