鲊廣椒真菌多樣性及其對滋味品質影響的評價

王玉榮，代凱文，沈 馨，董 蘊，周書楠，郭 壯,*

（1.湖北文理學院化學工程與食品科學學院，鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.當陽市食品藥品監督管理局，湖北 當陽 444100）

作為我國特色傳統發酵食品，湖北宜昌地區制作的鲊廣椒以大米面、鮮紅辣椒和食鹽為主要原料，室溫下發酵15～20 d而成，具有酸辣適口、滋味鮮香的特點。鲊廣椒的發酵通常在倒扣于水盆的壇子中完成，同時壇口會塞入半壇稻草以防止原料浸入水中[1]。雖然發酵過程均在密封環境中完成[2]，但發酵初始階段壇中存在的一定量空氣，為專性好氧真菌的生長提供了必要的氧氣。此外，鲊廣椒的制作環境相對開放，加之環境中存在少量兼性厭氧和微好氧真菌，因而發酵好的鲊廣椒產品中存在一定量的真菌，而該部分真菌的存在可能會對產品品質及使用安全性產生一定的影響，所以對鲊廣椒中真菌多樣性進行評價是極為必要的。

以Illumina MiSeq測序平臺為代表的第2代測序技術具有通量高和檢測速度快的特點[3]，通過為每個樣品在測序前加上一段被稱作樣品特異性條形碼或者標簽的核苷酸序列，實現了多樣本的平行實驗[4]，解決了傳統指紋圖譜技術不能進行關聯分析的缺點[5]。近年來，該技術被廣泛應用于酸奶[6]、臘腸[7]、葡萄酒[8]、窖泥[9]和泡菜[10]等發酵食品微生物多樣性研究和特異菌種的檢測中，為全面和深入研究不同發酵食品基質中微生物分子生態學提供了新的技術手段。電子舌實現了食品酸味、苦味、澀味、鮮味、咸味、甜味、苦味回味、澀味回味和鮮味回味的數字化評價，具有結果穩定且受外界影響小的優點[11]，目前已經廣泛應用于米酒[12]、啤酒[13]、水產品[14]和醋[15]等發酵食品的滋味品質評價中。

本研究從湖北省宜昌市當陽地區農戶家中采集了10 個鲊廣椒樣品，首先采用MiSeq高通量測序技術對其真菌微生物多樣性進行評價，繼而使用電子舌系統對各滋味指標相對強度進行測定，最終對真菌多樣性與鲊廣椒滋味品質進行了關聯性分析，以期對后續鲊廣椒產品品質改良及安全性評價提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鲊廣椒采集自湖北省當陽市草埠湖鎮和玉泉辦事處10 個農戶家。

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit食品DNA基因組提取試劑盒 德國QIAGEN公司；5×TransStartTMFastPfu Buffer、FastPfu Fly DNA Polymerase、dNTPs Mix北京全式金生物技術有限公司；DNA 1000試劑盒美國Agilent公司；味覺標準溶液、陰離子和陽離子溶液、內部溶液及參比溶液 日本Insent公司。

1.2 儀器與設備

MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司；R920機架式服務器 美國Dell公司；SA 402B電子舌（配備AAE、CT0、CA0、AE1、C00和GL1測試傳感器）日本Insent公司；2100芯片生物分析儀 美國Agilent公司；5810R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠；ND-2000C微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統 美國Bio-Rad公司；vetiri梯度基因擴增儀 美國AB公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品微生物宏基因組DNA提取

取1.0 g鲊廣椒，參照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒說明書進行DNA提取，檢測合格后的DNA樣品置-20 ℃暫存備用。

1.3.2 真菌18S rRNA V4～V5區聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增

正向引物為SSU0817F（5’-TTAGCATGGAA TAATRRAATAGGA-3’），反向引物為SSU1196R（5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’）[16]，其中在正向引物中加入7 個核苷酸標簽（barcode）。PCR擴增體系為：4 μL 5×PCR緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs mix，0.8 μL 5 μmol/L正向引物，0.8 μL 5 μmol/L反向引物，0.4 μL 5 U/μL DNA聚合酶，10 ng DNA模板，體系用ddH2O補充至20 μL。PCR擴增條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30 個循環；72 ℃ 10 min。

1.3.3 樣品平衡及MiSeq高通量測序

將10 個經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格的擴增產物按照100 nmol/L濃度進行稀釋混勻后，送至上海美吉生物醫藥科技有限公司使用MiSeq高通量測序平臺進行測序。1.3.4 序列質控

根據成對序列之間的重疊（overlap）關系，將下機的雙端序列數據拼接（merge）成一條序列。在序列拼接過程中根據以下標準進行質控：overlap區的堿基數需大于10 bp；最大錯配比率需小于等于0.2；拼接好的序列需無barcode堿基錯配；引物堿基錯配數需小于等于2 bp。

序列拼接后，依照barcode信息將下機序列劃分到各樣品，對序列方向進行校正后切掉barcode和引物，進而得到高質量的序列。若切掉barcode和引物后的序列其堿基數小于50 bp，則該序列亦予以切除。

1.3.5 生物信息學分析

質控合格后的序列，采用QIIME（v1.70）平臺[17]進行真菌微生物物種分析和多樣性評價[14]。主要的處理流程為：1）采用PyNAST校準并把序列排齊[18]；2）首先在100%相似性下進行UCLUST歸并[19]，建立無重復的單一的18S rRNA V4～V5區序列集，繼而在97.0%相似性下進行序列歸并，構建分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）矩陣；3）應用ChimeraSlayer去除含有嵌合體序列的OTU序列[20]；4）使用SILVA數據庫[21]進行序列同源性比對，在門、綱、目、科和屬水平上對其分類學地位進行明確；5）使用FastTree軟件，繪制基于OTU代表序列的系統發育進化樹[22]；6）采用發現物種數和香農指數（Shannon-Wiener index）等α多樣性指標分別對單個樣品真菌微生物的豐富度和多樣性進行評價，同時，采用稀疏曲線和香農指數曲線對測序深度是否滿足后續分子生物學分析進行評估[23]；7）分別基于UniFrac距離[24]進行主坐標分析和非加權組平均（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）法聚類分析，進而完成不同樣品間真菌微生物的β多樣性分析。

1.3.6 核酸登錄號

本研究中所有序列數據已提交至MG-RAST數據庫，登錄號為mgp81949。

1.3.7 基于電子舌技術鲊廣椒滋味品質的評價

稱取10 g鲊廣椒樣品于190 mL蒸餾水中，3 000 r/min離心10 min后取上清液過濾，按照下述步驟對鲊廣椒樣品酸、苦、澀、咸、鮮等基本味及澀、苦和鮮味回味進行測定[25]：1）將C00和AE1傳感器浸泡在陽離子溶液中，CA0、CT0和AAE傳感器浸泡在陰離子溶液中，5 個傳感器浸泡時間均為90 s，以去除傳感器上的吸附物；2）5 個傳感器在參比溶液1和2中分別洗滌120 s后，在參比溶液3中浸泡30 s，測得參比溶液的電勢值Vr；3）5 個傳感器在某鲊廣椒樣品中浸泡30 s，測得電勢值Vs，通過計算Vs-Vr值即可得到樣品酸、苦、澀、咸和鮮味5 個基本味的相對強度值；4）傳感器C00、AE1和AAE于參比溶液4和5中分別洗滌3 s后，于參比溶液6中浸泡30 s，測得電勢Vr’，通過計算Vr’-Vr值即可得到樣品后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）和豐度（鮮的回味）的相對強度值。每個樣品重復測定4 次，選后3 次納入數據分析。

GL1傳感器在陰離子溶液中浸泡90 s后，參照上述程序單獨對鲊廣椒樣品的甜味進行測定。每個樣品重復測定5 次，選后3 次納入數據分析。

1.3.8 多元統計學分析

使用皮爾森相關性分析法對平均相對含量大于1.0%的真菌屬之間的相關性進行計算，并采用熱圖對結果進行展示；亦使用皮爾森相關性分析法對鲊廣椒中優勢真菌屬和電子舌各滋味指標相對強度之間的相關性進行計算，同時選取相關系數絕對值大于0.5的指標，采用Cytoscape軟件（v3.5.1）進行相關性網絡圖繪制。使用Origin 8.5軟件（OriginLab Corp，MA，USA）和R軟件（v3.3.2）進行作圖。

2 結果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

在提取鲊廣椒樣品宏基因組DNA的基礎上，本研究采用MiSeq高通量測序技術，對鲊廣椒樣品中真菌微生物多樣性進行了評價。樣品18S rRNA測序情況及各分類地位數量如表1所示。

表1 樣品18S rRNA測序情況及各分類地位數量Table 1 18S rRNA read counts and number of identifiable units at different taxonomical levels

由表1可知，10 個鲊廣椒樣品共產生了376 256 條高質量的18S rRNA序列，平均每個樣品產生37 626 條。本研究采用兩步UCLUST法進行OTU的劃分，根據序列100%相似性聚類分析后，得到69 496 條代表性序列，繼而經過序列97.0%相似性聚類分析后，得到5 457 個OTU，經嵌合體檢查后去除14 個OTU，還剩余5 443 個OTU進行后續分析。本研究有18.45%的OTU和3.91%的序列（范圍為0%～14.11%，標準差為5.15%）不能鑒定到屬水平。

采用稀疏曲線和香農指數曲線，本研究進一步對現有測序深度是否滿足后續分子生物學分析進行了評估，其結果如圖1所示。

圖1 稀疏曲線圖（A）和香農指數圖（B）Fig. 1 Rarefaction analysis (A) and Shannon diversity estimates (B)

由圖1可知，隨著測序深度的增加，鲊廣椒樣品中發現真菌物種數的數量亦隨之增大且稀疏曲線尚未進入平臺期，而香農指數曲線已完全達到平衡狀態。由此可見，隨著測序深度的增加雖然有新的真菌種系型可能被發現，但本研究已經完全捕獲到了鲊廣椒樣品中真菌類群的多樣性信息，因而本研究的測序深度可以滿足后續生物信息學分析要求[26]。

2.2 基于各分類學地位相對含量的鲊廣椒真菌微生物構成分析

在門水平上，鲊廣椒樣品中微生物主要隸屬于7 個真菌門，其中Ascomycota（子囊菌門）的平均相對含量高達99.97%。在屬水平上，共發現135 個真菌屬，鲊廣椒中優勢真菌屬相對含量的比較分析如圖2所示。

圖2 鲊廣椒中優勢真菌屬相對含量的比較分析Fig. 2 Relative abundances of the major fungal genera in Zhaguangjiao samples

由圖2可知，鲊廣椒中隸屬于Ascomycota（子囊菌門）且平均相對含量大于1.0%的真菌屬及其相對含量分別為：Candida（念珠菌屬，56.63%）、Eurotium（曲霉菌屬，10.12%）、Pichia（畢赤酵母屬，11.19%）、Fusarium（鐮刀霉屬，2.67%）、Galactomyces（地霉屬，2.48%）、Cladosporium（分枝孢子菌屬，2.21%）和Debaryomyces（德巴利氏酵母屬，1.01%）。此外，還有隸屬于Basidiomycota（擔子菌門）的Guehomyces（久浩酵母屬），其平均相對含量為1.50%。由此可見，當陽地區鲊廣椒主要是由若干個隸屬于Ascomycota（子囊菌門）已知的優勢真菌屬組成，其平均累計含量為86.32%。Candida（念珠菌屬）和Pichia（畢赤酵母屬）在10 個樣品中均存在，其平均累計含量分別為67.82%。平均相對含量大于1.0%的真菌屬相關性的熱圖如圖3所示。

由圖3可知，Galactomyces（地霉屬）與Candida（念珠菌屬）呈顯著負相關（R=-0.673，P＜0.05），與Eurotium（曲霉菌屬）呈極顯著正相關（R=0.893，P＜0.01），Guehomyces（久浩酵母屬）與Fusarium（鐮刀霉屬）呈極顯著正相關（R=0.867，P＜0.01），Debaryomyces（德巴利氏酵母屬）與Fusarium（鐮刀霉屬，R=0.667）和Guehomyces（久浩酵母屬，R=0.719）均呈顯著正相關（P＜0.05）。本研究進一步在OTU水平上對鲊廣椒真菌微生物的多樣性進行分析，OTU在10 個樣品中出現次數統計如圖4所示。

圖3 平均相對含量大于1.0%的真菌屬相關性的熱圖Fig. 3 Heat map of correlation among the fungal genera with relative abundances more than 1.0%

圖4 OTU在10 個樣品中出現次數統計Fig. 4 Distribution of OTU as a function of their prevalence in the 10 samples

由圖4可知，納入本研究的樣品共產生5 443 個OTU，然而在10 個樣品中僅出現1 次的OTU有4 715 個，占OTU總數的86.63%，所包含序列數為13 070 條，僅占所有質控后合格序列數的3.47%。10 個樣品沒有共有的OTU，僅有5 個OTU存在9 個樣品中，其包含序列數為203 208 條，高達所有質控后合格序列數的54.01%。由此可見，在OTU水平上，雖然若干鲊廣椒樣品存在大量的核心真菌菌群，但某些樣品間微生物群落結構的構成存在較大差異。

2.3 基于多元統計學分析的鲊廣椒真菌微生物構成分析

通過上述分析，本研究發現雖然多數鲊廣椒樣品存在大量的核心真菌菌群，但某些樣品間微生物群落結構的構成存在較大差異，因而本研究進一步采用基于OTU水平的加權UniFrac距離主坐標分析和UPGMA聚類分析，對10 個鲊廣椒樣品的β多樣性進行了分析，基于分類操作單元的加權UniFrac距離的主坐標分析如圖5所示。

圖5 基于分類操作單元的加權UniFrac距離的主坐標分析Fig. 5 Principal coordinate analysis of OTUs based on weighted UniFrac distance

由圖5可知，10 個鲊廣椒樣品呈現明顯的分離趨勢，其中DY1、DY2、DY5和DY8，DY4、DY6、DY7和DY9，DY3和DY10分別呈現出聚類趨勢。基于分類操作單元的加權UniFrac距離的UPGMA聚類分析如圖6所示。

圖6 基于分類操作單元的加權UniFrac距離的UPGMA聚類分析Fig. 6 UPGMA clustering analysis of OTUs based on weighted UniFrac distance

由圖6可知，10 個樣品整體上可以分為3 個聚類，其中聚類I由樣品DY4、DY6、DY7和DY9構成，聚類II由樣品DY1、DY2、DY5和DY8構成，聚類III由DY3和DY10構成，這與基于分類操作單元的加權UniFrac距離的主坐標分析結果一致，亦進一步證實了雖然若干鲊廣椒樣品存在大量的核心真菌菌群，但某些樣品間其微生物群落結構構成存在較大的差異。通過Krushkal-Wallis檢驗發現，隸屬于不同聚類的樣品除Eurotium（曲霉菌屬）和Guehomyce（久浩酵母屬）外，其他優勢真菌屬差異均不顯著（P＞0.05）。

2.4 鲊廣椒優勢真菌屬及滋味品質的關聯性分析

圖7 鲊廣椒各滋味指標相對強度值的箱形圖（n=10）Fig. 7 Box plot of relative intensity of each taste index (n = 10)

在采用MiSeq高通量測序技術對真菌微生物多樣性進行揭示的基礎上，使用電子舌對鲊廣椒樣品的滋味品質進行評價，在此基礎上構建了優勢真菌屬與產品滋味品質相關性的網絡圖。鲊廣椒各滋味指標相對強度值的箱形圖如圖7所示。

由圖7可知，鲊廣椒樣品在酸味上的差異最大，其次為咸味、甜味和鮮味，而在苦味、澀味、后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）和豐度（鮮的回味）指標上的差異較小。鲊廣椒優勢真菌屬和滋味物質相關性的網絡圖如圖8所示。

圖8 鲊廣椒優勢真菌屬和滋味物質相關性的網絡圖Fig. 8 Correlation network diagram of major fungal genera and taste attributes in Zhaguangjiao samples

由圖8可知，Pichia（畢赤酵母屬）與鲊廣椒苦味呈正相關；Debaryomyces（德巴利氏酵母屬）和Guehomyce（久浩酵母屬）與鲊廣椒澀味呈正相關；Debaryomyces（德巴利氏酵母屬）、Galactomyces（地霉屬）和Eurotium（曲霉菌屬）與鲊廣椒后味A（澀味的回味）呈正相關；Galactomyces（地霉屬）與后味B（苦味的回味）呈正相關。苦味、澀味、后味A和后味B均為鲊廣椒的缺陷型指標，由此可見，優勢真菌屬多與鲊廣椒品質的缺陷性指標相關，真菌含量過高可能不利于產品滋味品質的形成。

3 討 論

近年來出現的以Illumina MiSeq為代表的第2代高通量測序技術可以全面、客觀、無偏地了解某一微生態系統中微生物群落結構，具有通量高、檢測速度快和檢測結果準確的特點[27]。本研究采用該技術對當陽地區鲊廣椒中真菌微生物多樣性進行了評價，結果發現念珠菌屬、曲霉菌屬和畢赤酵母屬為其優勢真菌屬，相對含量占到了真菌數的近八成。念珠菌是真菌中最常見的條件致病菌，曲霉菌屬亦是引起多種物質霉腐的主要微生物之一，且鲊廣椒樣品中亦存在隸屬于鐮刀菌屬、地霉屬和分枝孢子菌屬的腐敗真菌[28]。制作鲊廣椒的發酵方式為厭氧發酵，然而發酵初始階段壇中存在的空氣及發酵后期居民常開壇取食鲊廣椒，均為真菌的生長提供了必需的氧氣，使鲊廣椒受腐敗真菌污染的機率大大增加。此外，制作鲊廣椒的壇子常倒扣于水盆中并置于墻角或房檐下，用于密封的水亦常因家禽飲用或雨水濺入而發臭，這也增加了鲊廣椒被腐敗真菌污染的機會。由此可見，改善鲊廣椒加工環境進而抑制腐敗霉菌的生長，對保障鲊廣椒的食用安全性具有積極的意義。

在采用MiSeq高通量測序技術對真菌微生物多樣性進行評價的基礎上，本研究使用電子舌系統對各滋味指標相對強度進行測定，結果發現鲊廣椒樣品在酸味上的差異最大，這可能與樣品中乳酸菌含量不同有關[29]，因為除真菌外鲊廣椒中亦存在大量細菌。此外，通過將真菌多樣性與鲊廣椒滋味品質進行關聯性分析發現，優勢真菌屬多與鲊廣椒品質的缺陷性指標相關，因而綜上所述，當陽地區鲊廣椒中真菌微生物主要隸屬于念珠菌屬、曲霉菌屬和畢赤酵母屬，且其含量過高可能不利于產品滋味品質的形成。此外，MiSeq高通量測序技術存在讀長短的缺陷，因而二代測序只能在屬的水平上研究樣本中菌群的組成和變化，難以精確到種水平上[30]，因而在后續研究中積極引入新的測序技術并實現鲊廣椒樣品中活的真菌的絕對定量，對鲊廣椒產品品質改良及安全性評價將具有積極的意義。