大豆油和月桂酸制備MLM型結構脂質工藝優化及其性質分析

王 博，鞠興榮*，周潤松，何 榮，季圣陽

（南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

大豆油是中國人最常用的食用油脂之一，目前中國大豆油的進口量居世界首位[1]。大豆油原料比較豐富，獲取途徑比較容易且價廉。月桂酸屬于飽和脂肪酸，其心血管疾病風險比其他飽和脂肪酸要低，在椰子油、棕櫚仁油這些天然油脂中大量含有[2]。月桂酸單甘油酯具有較強的抗原蟲、抗菌、抗病毒、抗感染的能力，廣泛應用于嬰幼兒奶粉、米粉等產品中。Li Qingsheng等[3]在以雌猴為研究對象的實驗中發現，月桂酸單甘油酯可以有效幫助雌猴避免感染猴免疫缺陷病毒。

結構脂質是指采用一定的方法[4-5]對天然油脂進行改性，進而甘油三酯骨架上的脂肪酸種類和含量發生變化，使其具有特定生理功能和營養價值[6-9]。甘油三酯s,n-1,3位上含有中鏈脂肪酸（medium chain fatty acids，MCFA）（C6:0～C12:0）[10]，s,n-2位置含有必需長鏈脂肪酸所形成的結構脂質稱為中長碳鏈（middle-longmiddle，MLM）型結構脂質[11-12]。消化過程中，油脂先與膽汁、胰汁混合，乳化形成微粒結構，再被水解成脂肪酸、2-單甘酯和少量甘油[13]。然而，MCFA在消化時不需要與其他脂類物質形成乳糜微粒[14]，也不易與蛋白質結合形成脂蛋白，不會增加血液中膽固醇的含量，具有一定調節血脂作用[15-16]。Ifeduba等[17]用高硬脂酸大豆油和辛酸合成結構脂質，改善了其結構與性能。Moreira等[18]使用大豆油和橄欖油得到富含必需脂肪酸的油脂。此外，辛酸或癸酸作為底物合成MLM結構脂質研究也有諸多報道[17,19]。由此可見，提高油脂中MCFA含量，開發具有特定生理功能和營養價值的MLM型結構脂質成為研究熱點[20-22]。

本研究以大豆油和月桂酸作為反應底物，采用Lipozyme RM IM催化合成MLM型結構脂質，并通過響應面試驗分析底物（月桂酸∶大豆油）物質的量比、反應時間、反應溫度、脂肪酶添加量4 個因素對生成的結構脂質中月桂酸插入率的影響，明確最佳制備工藝，并分析在該條件下合成的MLM型結構脂質理化性質，為開發抗肥胖、降血脂的優質油脂提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

固定化1,3位置特異性脂肪酶Lipozyme RM IM丹麥Novozyme公司；精煉大豆油 鎮江中儲糧油脂有限公司；月桂酸（純度＞98%） 麥克林生化科技有限公司；脂肪酸甲酯混標 美國Sigma公司；所有實驗用有機溶劑均為分析純或色譜純。

1.2 儀器與設備

6890N氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；SHA-B恒溫水浴振蕩器 常州華冠儀器有限公司；N-1100D-WD旋轉蒸發儀 上海珂淮儀器有限公司；PE DSC8000差示掃描量熱儀 美國珀金埃爾默有限公司；BSA223S-CW電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；J6冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶法制備MLM型結構脂質工藝流程

取1 mmol精煉大豆油置于25 mL錐形瓶，按一定物質的量比例加入月桂酸顆粒，3 mL正己烷，適量脂肪酶，以及酶質量8%的去離子水，在一定反應溫度條件下，以180 r/min攪拌速率反應一定時間后，離心（4 000 r/min，10 min）去除脂肪酶，得到的反應產物經旋轉蒸發除去溶液中正己烷，得到制備MLM型結構脂質的混合物。

1.3.2 結構脂質的分離純化

采用堿性萃取脫酸法除去1.3.1節制備的MLM型結構脂質混合物中游離脂肪酸[23-24]。具體操作如下：先在上述混合物中加入10 mL 95%乙醇溶液和1 滴1%酚酞的乙醇溶液，混合均勻，逐滴加入0.7 mol/L KOH溶液直至溶液出現粉紅色且在30 s內不褪色，轉移至分液漏斗中，加入15 mL正己烷劇烈振蕩后靜置分層，收集上層（正己烷與MLM型結構脂質）溶液，通過無水硫酸鈉柱除去溶液中殘留水，轉移至旋轉蒸發器中除去正己烷，并用氮吹儀除去多余有機溶劑，即獲得制備MLM型結構脂質，-20 ℃保存備用。

1.3.3 氣相色譜分析

SP-2560毛細管柱（100 m×0.25 mm，0.25 μm）；氫離子化檢測器；進樣口溫度240 ℃；分流比50∶1；進樣量1.0 μL；載氣N2流速2 mL/min；升溫程序：初溫140 ℃保持5 min，以5 ℃/min的速率升溫至240 ℃，保持30 min。

1.3.4 熔融特性分析

取4～6 mg樣品放在10 μL容量的鋁盤中壓片，使用差示掃描量熱儀測定1.3.2節制備的MLM型結構脂質熔融特性。升溫條件：第1階段：樣品從室溫快速加熱至80 ℃，保持10 min；第2階段：將樣品以10 ℃/min速率冷卻至-40℃，保持30 min；第3階段：樣品以5 ℃/min速率加熱至80 ℃。

1.3.5 理化指標測定

酸價測定參照GB/T 5009.229—2016《食品中酸價的測定》，結果以KOH計；皂化值測定參照GB/T 5534—2008《動植物油脂 皂化值的測定》，結果以KOH計；碘值測定參照GB/T 5532—2008《動植物油脂 碘值的測定》；煙點測定參照GB/T 20795—2006《植物油脂煙點測定》。

1.3.6 單因素試驗

單因素試驗中各因素的固定值分別為底物（月桂酸∶大豆油）物質的量比4∶1，反應時間20 h，反應溫度45 ℃，脂肪酶添加量為底物質量的10%。保持其他3 個因素不變，每次改變1 個因素，設計底物物質的量比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1，反應時間分別為12、14、16、18、20、22、24、26 h，反應溫度分別為30、35、40、45、50、55、60、65 ℃，脂肪酶添加量分別為4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%，以月桂酸插入率作為評價指標，計算公式如下：

式中：C為月桂酸插入率/%；A1為結構脂質中月桂酸甲酯氣相色譜圖中對應峰面積；A2為結構脂質中所有脂肪酸甲酯氣相色譜圖所對應峰面積。

1.3.7 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計方案，以底物物質的量比（A）、反應時間（B）、反應溫度（C）脂肪酶添加量（D）為考察變量，以月桂酸插入率為響應值（Y），設計4因素3水平響應面試驗，確定最佳工藝。每一變量的低、中、高水平分別以-1、0、1編碼，試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used for Box-Behnken design

1.4 數據處理

所得數據采用Excel和SPSS 20.0軟件進行均值方差分析，使用Origin 8.5 Pro軟件進行繪圖分析。響應面試驗用Design-Expert 8.0軟件進行試驗設計并對回歸模型進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

由圖1A可以看出，底物（月桂酸∶大豆油）物質的量比對酸解反應具有較大影響，在底物物質的量比為5∶1時，月桂酸插入率達到最大值，然而當底物物質的量比大于5∶1時，月桂酸插入率沒有再繼續增加反而出現下降趨勢。可能是高水平的游離脂肪酸會產生大量的羧酸基團，從脂肪酶表面剝奪必需的水分，從而導致反應介質被破壞，反應朝著逆反應方向進行[25]。Nunes等[26]在研究橄欖油與辛酸或癸酸優化反應中，得到最佳比例為2.8∶1和3∶1，可能是月桂酸熔點高常溫條件下呈固體，需要更多的量才能使反應充分進行。由圖1B可知，當反應時間小于22 h，月桂酸插入率隨著反應時間的延長呈現很明顯的增加趨勢，但反應時間在22～26 h時，月桂酸插入率的增長趨勢表現相對平穩。不同溫度脂肪酶催化效果不同[27]，如圖1C所示，在45 ℃時，月桂酸的插入率效果最好，與Lipozyme RM IM最佳催化溫度（45 ℃）相一致。如圖1D所示，脂肪酶添加量為12%時，月桂酸插入率達到最大值。然而，過高的脂肪酶添加量并沒有明顯提高月桂酸插入率，主要由于底物濃度限制，多余的脂肪酶并未能參與催化反應[28]。

圖1 各因素對月桂酸插入率的影響Fig. 1 Effects of various factors on the insertion rate of lauric acid

2.2 MLM型結構脂質合成工藝條件的優化

2.2.1 響應面試驗優化結果

表2 響應面試驗設計方案及結果Table 2 Experimental design with response variable

在單因素試驗基礎上，繼續對提取條件進行優化。采用響應面軟件Design-Expert 8.0.6設計試驗方案，并對結果進行回歸分析，見表2。經回歸擬合，可以得到月桂酸插入率（Y）對底物物質的量比（A）、反應時間（B）、反應溫度（C）、脂肪酶添加量（D）的回歸方程：Y=29.44＋4.57A＋0.32B＋0.12C＋0.94D-0.12AB＋0.17AC-0.34AD-0.27BC-0.75BD-0.56CD-4.44A2-1.78B2-1.51C2-2.38D2。

2.2.2 模型方程建立與顯著性檢驗

由表3可知，此模型P值小于0.000 1，達到極顯著水平，且失擬項不顯著（P=0.185 3＞0.05），校正模型的相關系數R2為0.907 8，決定系數為0.926 1，說明回歸模型與實際值擬合良好，能較好地反映出各因素對月桂酸插入率的影響。由表3可以看出，一次項中，底物物質的量比（A）、反應時間（B）影響極顯著（P＜0.001）、脂肪酶添加量（D）影響顯著（P＜0.05），二次項中，BC、C2影響顯著（P＜0.05），A2、B2、D2影響極顯著（P＜0.001）。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.3 各因素交互作用對月桂酸插入率的影響

從圖2a～c可以看出，底物物質的量比的曲線最陡，幅度最大，可知底物物質的量比對產物中月桂酸插入率影響最顯著。從圖2a、d、e可以看出，反應時間的曲線比較平緩，而從圖2c、e、f可以看出，脂肪酶添加量的曲線也比較平緩，因此，反應時間與脂肪酶添加量對月桂酸插入率的影響程度小于底物物質的量比。由圖2b、d、f可以看出，反應溫度的響應面曲線幅度最為平滑，反應溫度對月桂酸插入率的影響最小。

在選取的試驗因素和水平范圍內，根據回歸模型分析，以月桂酸插入率為評價指標，可以確定最佳的提取工藝條件為底物物質的量比5.9∶1、反應時間23.56 h、反應溫度45.28 ℃、脂肪酶添加量13.03%，該條件下的月桂酸插入率預測值為29.87%。在實際操作中，將工藝條件修正為底物物質的量比6∶1、反應時間24 h、反應溫度45 ℃、脂肪酶添加量13%，3 次平行驗證實驗，月桂酸插入率的平均值為29.26%，與理論值基本相符，表明本實驗的優化工藝參數具有實際應用指導價值。

2.4 結構脂質物理化學性質分析

表4 大豆油和結構脂質理化性質分析Table 4 Physicochemical properties of soybean oil and MLM-type structured lipids

在最佳工藝條件下合成MLM型結構脂質，并測定其理化指標。如表4所示，碘值是衡量油脂中不飽和度的指標，MLM型結構脂質的碘值小于沒有改性的大豆油（106.45 g/100 g），主要因為在改性過程中加入的MCFA是飽和脂肪酸，油脂的不飽和度也隨之降低，碘值也隨之降低。此外，測定結果顯示MLM型結構脂質的皂化值要明顯大于原大豆油樣品（190.71 mg/g），說明接入月桂酸后，MLM中脂肪酸分子質量降低。黏度是流體對流動阻力的量度，通過脂肪酶酸解合成結構脂質由于插入MCFA，其具有更低的分子質量和不飽和程度，對黏度產生一定的影響，所以MLM型結構脂質黏度（70.39 cP）小于大豆油黏度（78.61 cP）。制備的MLM型結構脂質煙點比大豆油樣品略有提高，但無顯著差異（P＞0.05）。品質沒有受到加工過程的影響。與Jennings等[29]測定結果相一致。

2.5 結構脂質熔融特性分析

圖3 大豆油和結構脂質熔融結晶曲線圖Fig. 3 DSC thermograms of soybean oil and structured lipids

油脂的熱性能受甘油三酯種類、脂肪酸組成和飽和度的影響[30]。從圖3可以看出，MLM型結構脂質的熔融開始溫度為-19.87 ℃，比大豆油（-32.52 ℃）高。原大豆油結晶開始溫度為-7.65 ℃，MLM型結構脂質結晶開始溫度為4.89 ℃，說明MLM型結構脂質具有更高的結晶點。因此，MLM型結構脂質有和大豆油不一樣的熔融特性。熔融曲線特點與Jennings等[29]研究結果相同。

3 結論與討論

MLM型結構脂質是改性油脂研究的熱點，由于其特殊的結構特征，在體內消化時不會與其他脂類物質形成乳糜微粒，可以快速為人體供能，減少體內脂質的堆積。Moreira等[18]使用橄欖油，Ifeduba[17]和Jennings[19]等使用辛酸或癸酸作為底物合成MLM結構脂質研究都有諸多報道。本研究對大豆油和月桂酸合成MLM型結構脂質的合成工藝進行優化，結果表明，其最佳酶催化合成工藝條件為底物（月桂酸∶大豆油）物質的量比6∶1、反應溫度45 ℃、反應時間24 h、脂肪酶添加量13%，該條件下月桂酸的插入率可以達到29.26%。理化性質方面，MLM型結構脂質的碘值、黏度要低于大豆油，皂化值和熔融結晶溫度均高于大豆油，煙點略微升高，可以用于日常烘焙與食品制備。在后續研究中，進一步進行動物實驗和臨床研究，來確定MLM結構脂質的抗肥胖、降血脂等功能性作用，使其更安全有效地應用到日常生活中。