海南東寨港紅樹林內(nèi)生真菌Penicillium sp.黃酮類代謝產(chǎn)物*

凌惠平，郭思雨，賴寶龍，洪國康，曹灼賢，鄒庭光，譚健斌，王仲萍，陶移文

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州511436；2. 中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 深圳 518107)

青霉菌在自然界中分布廣泛，能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣，活性顯著的次級代謝產(chǎn)物。在青霉菌中發(fā)現(xiàn)的化合物種類超過1 300種，而其中的大多數(shù)都具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤或者抗心血管疾病等活性，是天然活性先導(dǎo)物的重要來源[1]。本課題組對分離自海南省東寨港自然保護(hù)區(qū)紅樹植物的Penicilliumsp. H1N1進(jìn)行了大規(guī)模發(fā)酵，并對其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化、鑒定，得到3個(gè)呫噸酮類和一個(gè)橙酮類化合物。呫噸酮類和橙酮類化合物廣泛分布于自然界中，具有良好的生物活性，包括抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗肥胖、拒食、除草等[2-3]，但大多數(shù)的黃酮類化合物都分離自植物，在動物和微生物中發(fā)現(xiàn)較少。

圖1 化合物1-4的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of compound 1-4

1 儀器與材料

薄層色譜硅膠GF254和柱色譜用硅膠(青島海洋化工廠有限公司)；常規(guī)試劑均為分析純；Varian INOVA 300NB核磁共振波譜儀(美國Varian公司)；VG ZAB -HS 雙聚焦質(zhì)譜儀(英國VG公司)；VG Autospec-500 質(zhì)譜(英國VG公司)； Bruker XSCANS 衍射儀(德國Bruker公司)；Agilent 1100 型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

菌株H1N1采自海南東寨港紅樹林，通過用真菌ITS引物ITS1和ITS4擴(kuò)增真菌18S DNA序列，所得到的序列在GeneBank中用Blast進(jìn)行相似性分析，鑒定為Penicilliumsp.，該菌種現(xiàn)保存于廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院。

2 提取與分離

菌株P(guān)enicilliumsp. H1N1采用葡萄糖(10 g/L)、蛋白胨(2 g/L)、酵母膏(1 g/L) 和粗海鹽(2 g/L) 配方進(jìn)行大規(guī)模(100 L) 的液體常溫靜置培養(yǎng)，35 d后，收集發(fā)酵液和菌絲體。發(fā)酵液濃縮到10 L后，用體積比為1∶1乙酸乙酯進(jìn)行萃取；菌絲體晾干，3倍體積甲醇浸泡24 h，分別回收溶劑，獲得發(fā)酵液提取物和菌絲體提取物，合并，待分離。

對粗提物進(jìn)行硅膠柱層析，得到20個(gè)流分，對各流分經(jīng)反復(fù)柱層析，凝膠柱層析，薄層層析和反相中壓制備后，得到3個(gè)呫噸酮類和1個(gè)橙酮類化合物。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色固體，EI-MSm/z：284，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C16H12O5，不飽和度為11；氫譜數(shù)據(jù)分析，δH12.14(1H, s) 顯示有1個(gè)氫鍵偶合的羥基，而δH7.74(1H, dd,J= 8.5, 7.3 Hz)，δH7.52(1H, dd,J= 8.5, 1.0 Hz) 和δH7.30(1H, dd,J= 7.3, 1.0 Hz)，顯示有1個(gè)含3個(gè)取代基的苯環(huán)，另外δH6.75(1H, d,J= 0.6 Hz) 和δH6.63(1H, d,J= 0.6 Hz) 顯示其為間位偶合的2個(gè)芳香氫，此外還有1個(gè)氧甲基[δH4.31(3H, s)] 和1個(gè)連在苯環(huán)上的甲基 [δH2.44(3H, s)]；碳譜數(shù)據(jù)顯示該化合物有16個(gè)C，其中δC180.6, 169.8為2個(gè)羰基碳，δC53.3為氧甲基碳，δC22.8為甲基，其余均為苯環(huán)上的碳。詳細(xì)數(shù)據(jù)如下：1H NMR(CDCl3, 300 MHz)δ: 12.14(1H, s), 7.74(1H, dd,J= 8.5, 7.3 Hz), 7.52(1H, dd,J= 8.5, 1.0 Hz ), 7.30(1H, dd,J= 7.3, 1.0 Hz), 6.75(1H, d,J= 0.6 Hz), 6.63(1H, d,J= 0.6 Hz), 4.31(3H, s), 2.44(3H, s);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 180.6, 169.8, 161.5, 156.1 155.8, 149.6, 134.9, 133.6, 122.6, 119.5, 117.7, 111.85, 107.5, 107.1, 53.3, 22.8。與文獻(xiàn)[4]數(shù)據(jù)比對，化合物1鑒定為：8-羥基-6-甲基呫噸酮-1-羧酸甲酯。該化合物經(jīng)氯仿溶解后常溫靜置，獲得黃色針狀晶體，X-單晶衍射結(jié)果驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。詳細(xì)數(shù)據(jù)如下：空間群：C2/c , a = 21.037(4) ?, b = 10.422(2) ?, c = 13.536(3)?,α= 90°,β= 114.552(3)°,γ= 90°, C16H12O5,Mr= 284.26,V= 2 699.7(11)3,Z=8,Dc= 1.399 g/cm3,F(000) = 1 184,μ= 0.879 mm-1,R= 0.054 2,wR= 0.161 2( 2 437 )，CCDC：1 582 459，與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致，晶體結(jié)構(gòu)如圖2。

化合物2：黃色固體，EI-MSm/z：270，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C15H10O5；相對分子質(zhì)量比化合物1少14，氫譜和碳譜分析發(fā)現(xiàn)，相比于化合物1，化合物2氫譜主要缺少δH4.31(3H, s)單峰，碳譜缺少了δC53.3的峰，δC168.8的峰向高場移動1.0，以此推斷化合物1的羧酸甲酯基團(tuán)經(jīng)脫甲基變成化合物2的羧基。與文獻(xiàn)[5]數(shù)據(jù)比對，鑒定為8-羥基-6-甲基呫噸酮-1-羧酸，詳細(xì)數(shù)據(jù)如下：1H NMR(CDCl3, 300 MHz)δ: 12.26(1H, s), 7.94(1H, dd,J= 8.5, 7.3 Hz), 7.69(1H，d,J= 8.5, 1.0 Hz ), 7.43(1H, d,J= 7.3, 1.0 Hz), 6.89(1H，d,J= 0.6 Hz), 6.65(1H, d,J= 0.6 Hz), 2.45(3H, s)；13C NMR(CDCl3,75 MHz)δ: 181.6, 168.8, 161.8, 156.3 156.1, 148.3, 137.1, 134.4, 124.6, 118.9, 114.7, 110.4, 108.6, 107.4, 21.4。

圖2 化合物1的晶體結(jié)構(gòu)Fig.2 The crystal structure of compound 1

化合物3：黃色固體，EI-MSm/z：314，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C16H10O7；化合物3的氫譜與化合物1相比，少了2.44的單峰；碳譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，化合物3比化合物1多了1個(gè)165.7的羧酸峰，少了1個(gè)22.8的甲基峰。與文獻(xiàn)[5]數(shù)據(jù)比對，鑒定為：8-羥基-6-甲基呫噸酮-1-羧酸甲酯。詳細(xì)數(shù)據(jù)如下：1H NMR(DMSO-d6, 300 MHz)δ: 12.06(1H, s), 7.99(1H, dd,J= 8.5, 7.3 Hz), 7.80(1H, dd,J= 8.5, 1.0 Hz), 7.48(1H, dd,J= 7.3, 1.0 Hz), 7.53(1H, d,J= 0.9Hz), 7.26(1H, d,J= 0.9 Hz), 3.91(3H, s);13C NMR(DMSO-d6,75 MHz )δ: 180.5, 168.5, 165.7, 160.6, 155.9, 155.3, 138.8, 136.5, 132.9, 123.2, 119.8, 116.7, 110.8, 110.5, 107.7, 52.8。

化合物4: 黃色固體，EI-MSm/z：254，結(jié)合氫譜和碳譜數(shù)據(jù)，推出化合物分子式為C15H10O4，不飽和度為11。δH6.48(1H, dd,J= 8.5, 3.5 Hz)，δH7.48(1H, d,J= 8.5 Hz )，δH6.38(1H, d,J= 3.5 Hz)，顯示有一個(gè)含3個(gè)取代基的苯環(huán)；另外，δH7.13(2H, dd, 7.2, 3.5 Hz)和δH6.68(2H, dd, 7.1, 3.5 Hz)表明存在1個(gè)對位雙取代的苯基；此外，δH7.00(1H, s)表明還存在1個(gè)sp2雜化的質(zhì)子。碳譜顯示，所有的碳都是sp2雜化的碳原子，δC182.0為羰基碳，對應(yīng)1個(gè)不飽和度，其它14個(gè)sp2雜化的碳對應(yīng)7個(gè)不飽和度，2個(gè)環(huán)(苯環(huán))對應(yīng)2個(gè)不飽和度，還剩下1個(gè)不飽和度，應(yīng)該還有1個(gè)環(huán)。綜合碳譜和氫譜數(shù)據(jù)，與文獻(xiàn)[6]數(shù)據(jù)比對，確定為：4′, 6-二羥基橙酮。詳細(xì)數(shù)據(jù)如下：1H NMR(CDCl3, 300 MHz)δ: 7.48(1H, d,J= 8.5 Hz), 7.13(2H, dd,J= 7.2 , 3.5 Hz ), 7.00(1H, s), 6.68(2H, dd,J= 7.2, 3.5Hz), 6.48(1H, dd,J= 8.5, 3.5 Hz), 6.38(1H, d,J= 3.5Hz) ;13C NMR(CDCl3, 75 MHz)δ: 182.0, 167.6, 165.0, 157.7, 147.1, 132.0, 127.8, 124.4, 115.8, 114.1, 114.1, 110.6, 103.1。

4 結(jié)果和討論

從青霉屬真菌的液體發(fā)酵提取物中共分離得到3個(gè)呫噸酮類和1個(gè)橙酮類化合物，表明菌株P(guān)enicilliumsp. H1N1有產(chǎn)生多種黃酮類化合物的能力。化合物1-3為呫噸酮類化合物，對KB和KBv 200細(xì)胞系無活性[5]。化合物4為橙酮類化合物，最早報(bào)道于1966年，分離自大豆中[6]，除有抗真菌作用外[7]，還是腺苷受體拮抗劑，并能選擇性拮抗A1受體[8]。

目前，黃酮類化合物主要是從植物中得到，由于植物生長周期長、原料有限以及分離難度大等客觀因素，限制了黃酮類化合物的藥理活性的深入研究和開發(fā)[9]。而橙酮類化合物作為一類稀少的類黃酮化合物，其獲得更加困難，主要是通過化學(xué)合成進(jìn)行制備，或產(chǎn)品單一或步驟繁瑣，違背了綠色化工的理念[10]。

黃酮類化合物的生源合成途徑研究表明它是由3個(gè)丙二酰輔酶A和1個(gè)桂皮酰輔酶A對不同的底物進(jìn)行修飾而成。 Farag M A等[7]在2009年已通過紫花苜蓿細(xì)胞揭示了化合物4的生源合成途徑。因?yàn)辄S酮類化合物的生源合成途徑短，所需催化酶簡單，而使得在微生物中對黃酮類化合物進(jìn)行生物合成和結(jié)構(gòu)修飾具有極大優(yōu)勢，迄今為止，研究人員已通過微生物合成方法獲得幾十個(gè)黃酮類化合物[9]。

但由于微生物合成黃酮類化合物受到底盤細(xì)胞自身遺傳和生化特性的限制，以及丙二酰輔酶A 在微生物體內(nèi)合成較少，且無法外源添加而導(dǎo)致黃酮類化合物產(chǎn)率較低[9]。而本課題組在青霉菌H1N1中分離得到兩種黃酮類化合物，說明青霉菌H1N1中含有指導(dǎo)呫噸酮類和橙酮類化合物合成的基因組，或許可為其生物合成提供新的途徑。