血管緊張素Ⅱ對結腸癌CT26細胞株增殖及侵襲的影響

楊蕭天， 蘇兆亮， 徐岷

(1. 江蘇大學附屬醫院消化內科， 江蘇 鎮江 212001； 2. 江蘇大學醫學院免疫學與免疫學檢驗系， 江蘇 鎮江 212013)

結腸癌是全球第三大常見惡性腫瘤，占所有腫瘤的10%，每年新增患者136萬例，死亡人數超過50萬[1]。臨床上多數結腸癌患者出現癥狀時，都已經是中晚期并出現了腫瘤的遠處轉移，錯失了治療時機。最近研究發現，血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)可以促進腫瘤的增殖和轉移，在乳腺癌中，血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)的異常表達以及TNF-α的異常表達可以促進腫瘤細胞的轉移和侵襲[2-4]。關于Ang Ⅱ在結腸癌中的表達及影響尚不清楚，因此，我們擬檢測Ang Ⅱ 及其受體阻滯劑對結腸癌CT26細胞株的生物學行為和TNF-α表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

結腸癌CT26細胞株 (美國ATCC細胞庫)；RPMI 1640培養液(美國Gibco公司)；胎牛血清購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司；PBS和0.25%胰酶(美國HyClone公司)；兔源AT1R抗體(臺灣Arigo公司)；小鼠來源的TNF-α、β-肌動蛋白抗體及熒光二抗購于武漢ABclonal公司；DAPI細胞核染液購于碧云天公司；CCK8試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司；TNF-α ELISA試劑盒購于聯科生物工程有限公司；Transwell小室(美國Corning公司)；基質膠(美國BD公司)；Ang Ⅱ和氯沙坦(美國Sigma公司)。

1.2 細胞培養

CT26細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，并置于37 ℃，5%CO2的恒溫箱中進行培養。

1.3 免疫熒光法檢測CT26細胞AT1R的表達

取對數生長期細胞接種于24孔板中，每孔細胞數為5×103個,孵箱培養24 h;棄上清液，取出細胞玻片，置于新的24孔板中，PBS浸洗3次，每次3 min；4%低聚甲醛固定20 min；PBS浸洗3次，每次5 min；0.5%Triton X-100通透10 min；PBS洗3次，每次5 min；BSA室溫封閉30 min；PBS浸洗3次，每次5 min；每張爬片滴加用PBS稀釋的AT1R一抗(1 ∶500)并放入濕盒，4 ℃孵育過夜；次日棄去一抗殘余液，PBS浸洗3次，每次5 min；滴加PBS稀釋的熒光二抗(1 ∶500)于細胞玻片上，室溫避光孵育1 h；PBS浸洗3次，每次5 min；于室溫避光條件下用DAPI染核10 min；PBS 洗3次，每次5 min；直接于熒光顯微鏡下觀察AT1R的表達并拍攝圖片。

1.4 CCK8法檢測CT26細胞增殖率

取對數生長期的CT26細胞，經胰酶消化后，接種于96孔板，每孔細胞數為3×103個。細胞貼壁后，分別加入3種濃度Ang Ⅱ(1×10-9、1×10-8、1×10-7mol/L)；每組設3個復孔；孵育72 h后，分別加入CCK8試劑(終濃度100 μL/mL)并于37 ℃，5%CO2恒溫箱中溫育1.5 h；用酶標儀在450 nm處讀取D值，根據D值計算細胞增殖率；選擇最適濃度的Ang Ⅱ進行后續實驗。

取對數生長期的細胞，經胰酶消化后，接種于96孔板，每孔細胞數為3×103個。待細胞完全貼壁后，分別加入3種不同濃度的氯沙坦(1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L)以確保氯沙坦與AT1R結合；每組設3個復孔，預處理2 h；棄去培養液，每孔加入含1×10-7mol/L Ang Ⅱ的培養液；孵育72 h后，分別加入CCK8試劑(終濃度100 μL/mL)并在37 ℃，5%CO2恒溫箱中溫育1.5 h；用酶標儀在450 nm處讀取D值，根據D值計算細胞增殖率；選取最適濃度的氯沙坦進行后續實驗。

1.5 侵襲實驗檢測CT26細胞侵襲能力

在Transwell上室內加入70 μL稀釋的基質膠，下表面涂以5%的明膠15μL，置于超凈臺中風干過夜，次日加入200 μL RPMI 1640培養液水化2 h；于24孔板內加入700 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640；收集對數生長期的CT26細胞，用無血清的RPMI 1640制成3×105/mL的細胞懸液，以300 μL體系加入Transwell上室：對照組下室不作處理；Ang Ⅱ組下室加入1×10-7mol/L Ang Ⅱ；氯沙坦+Ang Ⅱ組先用1×10-6mol/L氯沙坦預處理2 h，下室加入1×10-7mol/L Ang Ⅱ；每組設平行小室3個，在37 ℃，5%CO2恒溫箱中培養12 h；取Transwell小室，低聚甲醛固定20 min；用棉簽小心擦去未穿膜的細胞，結晶紫染色10 min；在倒置顯微鏡下觀察并拍攝圖像。

1.6 ELISA法檢測CT26細胞TNF-α含量

將對數生長期細胞接種于24孔培養板，每孔細胞數為1×105個；細胞貼壁后培養24 h，換用無血清培養液進行培養，將細胞分為對照組、AngⅡ組、氯沙坦+Ang Ⅱ組。對照組不作處理；AngⅡ組加入1×10-7mol/L Ang Ⅱ；氯沙坦+Ang Ⅱ組加入1×10-6mol/L氯沙坦預處理2 h，棄培養液，再加入含1×10-7mol/L Ang Ⅱ的無血清培養基。常規培養24 h后，收取各組細胞培養上清液，按ELISA試劑盒說明書進行操作，測定細胞培養液中TNF-α的含量。

1.7 蛋白質印跡法檢測CT26細胞AT1R及TNF-α蛋白的表達

取對數生長期細胞，接種于24孔板，每孔細胞計數為2×105個，待細胞貼壁后，將細胞分組，分組及每組處理同“1.6”；常規培養24 h后，收取各組CT26細胞；裂解細胞提取蛋白質，進行凝膠電泳(12% SDS-PAGE)，每孔蛋白上樣量為15 μL；待溴酚藍遷移至分離膠底部時，停止電泳；采用濕式轉膜裝置將目的蛋白轉移至PVDF膜；膜于BSA封閉液中室溫封閉1 h；滴加稀釋好的兔抗AT1R(1 ∶1 000)、鼠抗TNF-α(1 ∶500)和鼠抗β-肌動蛋白(1 ∶2 000)，置于4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；加入羊抗兔和羊抗鼠IgG(1 ∶2 000)二抗，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；加入ECL試劑，在化學發光成像儀下觀察并拍攝圖像。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 CT26細胞AT1R的表達

在熒光顯微鏡下觀察細胞中的熒光分布，綠色熒光為AT1R，細胞核顯示為藍色熒光(DAPI)，結果表明AT1R表達于CT26細胞(圖1)。

圖1 免疫熒光檢測CT26細胞AT1R的表達

2.2 Ang Ⅱ及氯沙坦對CT26細胞增殖的影響

CCK8實驗結果顯示(圖2)，與對照組相比，1×10-7moL/L Ang Ⅱ組細胞增殖率明顯升高(t=16.446，P<0.05)，而1×10-9moL/L及1×10-8moL/L Ang Ⅱ組細胞增殖率差異無統計學意義(P均>0.05)。故選用1×10-7moL/L的 Ang Ⅱ作為最適濃度，進行后續實驗。

與Ang Ⅱ組相比，1×10-7moL/L及1×10-6moL/L氯沙坦組細胞增殖率明顯降低(t=5.765，t=12.429，P<0.05)，而1×10-8moL/L氯沙坦組細胞增殖率差異無統計學意義(P>0.05，圖2)。故選用1×10-6moL/L的氯沙坦作為最適濃度，進行后續實驗。

a: P<0.05，與對照組相比

a：P<0.05，與1×10-7moL/L Ang Ⅱ組比較

2.3 AngⅡ及氯沙坦對CT26細胞侵襲能力的影響

體外侵襲實驗結果顯示，與對照組相比，Ang Ⅱ組細胞侵襲數明顯增多(t=7.24，P<0.05)；與Ang Ⅱ組相比，氯沙坦+Ang Ⅱ組細胞侵襲的數量明顯減少(t=5.856，P<0.05)。見圖3。

a：P<0.05，與對照組相比；b：P<0.05，與Ang Ⅱ組比較

2.4 AT1R表達及TNF-α蛋白的分泌與表達

ELISA檢測結果顯示(圖4)，與對照組相比，Ang Ⅱ組細胞上清液中TNF-α含量明顯升高(t=10.277，P<0.05 )；氯沙坦+Ang Ⅱ組細胞分泌的TNF-α較Ang Ⅱ組明顯降低(t=8.693，P<0.05)。蛋白質印跡結果顯示(圖5)，與對照組相比，Ang Ⅱ組細胞TNF-α表達量增多(t=17.298，P<0.05)；氯沙坦+Ang Ⅱ組腫瘤細胞TNF-α表達量較Ang Ⅱ組明顯減少(t=14.599，P<0.05)；與ELISA檢測結果相一致。

蛋白質印跡結果顯示，與對照組相比，Ang Ⅱ組AT1R表達量明顯增多(t=14.738，P<0.05)；與Ang Ⅱ組比較，氯沙坦+Ang Ⅱ組AT1R表達量顯著降低(t=12.571，P<0.05，圖6)。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與Ang Ⅱ組比較

a：P<0.05，與對照組相比；b：P<0.05，與Ang Ⅱ組相比

3 討論

腫瘤的轉移與侵襲是腫瘤惡化的主要原因。Ang Ⅱ參與多種腫瘤的調控，以往對Ang Ⅱ的研究主要集中于心血管疾病[5]，自1998年，Lever等[6]報道，接受血管緊張素轉換酶抑制劑治療的高血壓患者的腫瘤發生率明顯降低。研究表明腎素-血管緊張素系統(RAS)參與腫瘤的發展，Ang Ⅱ通過激活AT1R促進腫瘤生長和轉移[3,7-8]。本研究結果顯示，Ang Ⅱ可以激活并上調AT1R的表達，并且促進CT26細胞的增殖和侵襲能力。也有研究發現，ARB類藥物可以與AT1R特異性結合，從而阻止AngⅡ與AT1R的結合，達到抑制AngⅡ的作用[9-11]。本研究采用氯沙坦作為AT1R的阻滯劑，結果顯示，氯沙坦預處理CT26細胞后，AngⅡ的促腫瘤增殖和侵襲作用受到明顯抑制。由此推測，當Ang Ⅱ作用于CT26細胞后促進腫瘤的侵襲與轉移，但具體機制有待進一步的研究。

a：P<0.05，與對照組相比；b：P<0.05，與Ang Ⅱ組相比

此外，我們還發現，Ang Ⅱ在促進腫瘤增殖和侵襲的過程中，上調了TNF-α的表達。既往研究發現TNF-α具有抗腫瘤作用[12-13]；近來研究發現， TNF-α也參與多種腫瘤的遠處轉移，包括胰腺癌、前列腺、卵巢腫瘤等[14-18]；TNF-α可以通過上調MMP9、血管內皮生長因子的表達，誘導上皮間質轉化促進腫瘤的侵襲和轉移。TNF-α在腫瘤中的雙重作用值得進一步探究。本研究結果提示，Ang Ⅱ可能通過激活TNF-α促進結腸癌的侵襲。

氯沙坦已廣泛應用于高血壓病及腎臟疾病的治療，未出現嚴重的不良反應[19]，且經濟、易獲取，可應用于臨床抗腫瘤的治療。綜上所述，Ang Ⅱ增強結腸癌細胞的增殖能力，促進結腸癌細胞的侵襲，激活并上調TNF-α的表達，氯沙坦通過與AT1R的特異性結合抑制Ang Ⅱ促腫瘤增殖和侵襲的作用，但在侵襲方面的具體作用機制仍有待進一步研究。