苦瓜籽粗多糖的提取工藝及其體外抗氧化活性

李慧華， 余江南， 徐希明

(江蘇大學藥學院， 江蘇 鎮江 212013)

苦瓜是全株入藥的食物，有“藥用蔬菜”之稱，特別是其果實和種仁有很強的藥理活性[1]。《本草綱目》中記載了苦瓜籽的氣味及藥效，稱其“苦甘無毒，益氣壯陽”。迄今為止，國內外學者已經從苦瓜籽中分離出多種蛋白質、多肽、油脂等成分，并顯示出降血糖、抗腫瘤、抗病毒、降血脂及脂肪分解等藥理活性[2-4]。然而，研究苦瓜籽多糖成分的報道甚少，本文在單因素實驗的基礎上進行正交實驗，優化苦瓜籽粗多糖(bitter melon seeds polysaccharide, BMSP)的提取工藝，并考察其體外抗氧化能力，為苦瓜籽的合理開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

苦瓜籽購自河南省洛陽市中藥材市場；無水乙醇、石油醚、丙酮、乙醚、苯酚、濃硫酸、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍、三氯乙酸、三羥甲基甲胺、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧化氫、三氯化鐵、鹽酸、鄰苯三酚、維生素C、鐵氰化鉀等化學試劑均為分析純。

RE-2000A旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；L-550大容量離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；DHG-9245A 鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；紫外分光光度計(蘇州凈化設備有限公司)；酶標儀(上海普迪生物技術有限公司)。

1.2 苦瓜籽預處理

將干燥苦瓜籽粉碎后過80目篩，加入5倍體積的石油醚加熱回流3 h除去脂溶性物質，抽濾后棄去上清液，低溫干燥濾餅以揮發掉石油醚，再加5倍體積的 95%乙醇加熱回流 3 h，抽濾后棄去上清液，50 ℃干燥濾餅，得苦瓜籽粉末以備多糖提取用。

1.3 改良苯酚-硫酸法[5]建立葡萄糖標準曲線

分別精密吸取0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL葡萄糖溶液(濃度為1.0 mg/mL)于 25 mL的容量瓶中，加水至刻度線，配成濃度分別為10、20、40、60、80、100 μg/mL 的葡萄糖標準溶液，再分別吸取60 μL各濃度葡萄糖標準溶液[5]，平行取樣3次，加入180 μL 5%苯酚-硫酸溶液(即配即用)，渦旋1 min混勻，沸水浴加熱25 min，待反應完全后，冷卻至室溫，吸取200 μL加入96孔板中，以蒸餾水為參比，測定490 nm處光密度(D)值。以葡萄糖濃度為橫坐標，D值為縱坐標，得標準曲線為Y=0.007 5X+0.077 6，R2=0.999 3，表明葡萄糖濃度在10～100 μg/mL范圍有良好的線性關系。

1.4 BMSP的提取

稱取預處理的苦瓜籽粉末30 g(平行稱量3 份)于燒杯中，在一定條件下煎煮后，得到苦瓜籽水提液，濃縮至一定體積，加入4 倍體積的乙醇溶液，靜置12 h，離心后收集沉淀，再依次用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌2次，最終完全溶解于水中，離心，上清液凍干得BMSP沉淀。

吸取 60 μL 2.5 mg/mL BMSP沉淀溶液，按“1.3”項下方法進行操作，測定490 nm處的D值，可根據D值適當稀釋，再測定，并代入方程得出多糖濃度，最后代入下列公式計算BMSP得率。

多糖提取率=(提取的多糖質量/苦瓜籽質量)×100。

1.5 單因素實驗

以脫脂后的苦瓜籽粉末為原料，采用熱水煎煮法提取BMSP。影響BMSP提取的主要因素有提取溫度、時間、料液比和次數。本實驗提取溫度選取 60、70、80、90、100 ℃共5個水平，提取時間選取 1、1.5、2、2.5、3 h 這5個水平，苦瓜籽與水的料液比選取 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50 這5個水平，選取提取次數 1、2、3、4 次4個水平，分別進行單因素實驗。

1.6 正交設計

在單因素實驗結果的基礎上，選擇提取溫度(A)、提取時間(B)、料液比(C)和提取次數(D)這4個因素，每個因素下各3個水平，采用L9(34)正交實驗表設計實驗，以多糖提取率為考察指標，確定最優提取工藝，并進行驗證實驗。

1.7 BMSP沉淀中的蛋白質去除

因BMSP中含有的苦瓜籽蛋白具有較強抗氧化能力，會影響BMSP的抗氧化活性研究。因此我們參照文獻[6]中的方法，采用三氯乙酸脫蛋白法去除BMSP沉淀中的蛋白質。稱取適量的BMSP沉淀完全溶解于200 mL蒸餾水中，邊攪拌邊緩慢加入三氯乙酸溶液，使三氯乙酸的最終濃度為3%，其間不斷攪拌3 h，使蛋白質完全沉淀，再靜置2 h后，下層有蛋白質層析出。離心后棄去蛋白沉淀，將上清液收集濃縮，透析后凍干得BMSP。

1.8 考馬斯亮藍法測定BMSP中蛋白質含量[7]

精密吸取牛血清蛋白質標準液(濃度為100 μg/mL)0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于10 mL試管中，加入4 mL 0.01%考馬斯亮藍溶液G-250，加水補足至10 mL，混勻，室溫靜置25 min，檢測595 nm處的D值。以蛋白質的濃度為橫坐標，D值為縱坐標，繪制標準曲線。配制濃度為1.5 mg/mL BMSP多糖溶液，按“1.3”項下操作方法，檢測595 nm處D值。BMSP中蛋白質的含量=Wi/W×100%(Wi為根據標準曲線計算出的蛋白質質量，W為BMSP質量)。

1.9 BMSP抗氧化活性測定

1.9.1 清除 DPPH自由基能力的測定[8-9]稱取適量DPPH溶解于無水乙醇中配制成0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，分別吸取0.1，0.2,0.5,1,2,3 mg/mL BMSP溶液2 mL，加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，混合搖勻，常溫避光放置30 min，3 500 r/min離心10 min。取多糖上清液檢測517 nm處D值。采用無水乙醇溶液作為空白對照，維生素C為陽性對照，計算BMSP的清除率(%)，每個濃度平行做3次實驗。DPPH清除率=[1-(D多糖組-D對照組)/D空白組]×100。

1.9.2 Fenton反應法檢測羥自由基(·OH)清除率[10]在10 mL試管中依次加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液，2 mL pH=7.4的 PBS和1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液，邊加邊搖勻，再分別加入0.1，0.2,0.5,1,2,3 mg/mL 2 mL BMSP多糖溶液和1 mL 0.3%H2O2，用蒸餾水補足至10 mL，于 37 ℃水浴反應 1 h，于510 nm處測定D值。空白對照為緩沖溶液-蒸餾水(V∶V=1 ∶2)溶液，陽性對照為維生素C。·OH清除率=[(D多糖組-D對照組)/D空白組-D多糖組]×100。

1.9.4 普魯士藍法檢測總還原能力[12]在10 mL離心管中分別加入0.2 mol/L pH 6.6磷酸緩沖液2.5 mL和BMSP溶液1 mL(濃度分別為0.1,0.2,0.5,1,2,3 mg/mL)，加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀，混合均勻后于50 ℃反應20 min。取出后加入2.5 mL 10%三氯乙酸終止反應，3 500 r/min離心10 min。取出上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min，在700 nm處檢測D值，以蒸餾水代替0.1%三氯化鐵溶液作為空白對照。還原能力=D多糖組-D空白組。

2 結果

2.1 提取溫度

從圖1可以看出，提取溫度在60～100 ℃范圍內，多糖提取率呈現先上升再下降的趨勢，在90 ℃時多糖提取率最高，達5.18%，可能是由于當溫度較低時，多糖的溶解與滲透能力較低。在相同提取時間內，溫度較低時BMSP不能有效溶出，而溫度較高時多糖分子結構可能會發生一定的破壞，從而導致多糖提取率降低。考慮100 ℃時水分揮發快，不能完全浸潤提取，且多糖結構可能已被破壞，對后面的結構解析有一定影響。最終確定最佳提取溫度為90 ℃。為了進一步考察提取溫度對BMSP提取率的影響，選取70、80、90 ℃這3個水平進行正交優化分析。

圖1 不同提取溫度對苦瓜籽粗多糖提取率的影響

2.2 提取時間

從圖2可以看出，當提取時間從1 h增加到2 h時，BMSP提取率快速上升，到2 h時達到最大值，為4.61%，當超過2 h，多糖提取率反而降低。這可能是時間越長，多糖溶出的量越大，當細胞內外滲透壓逐漸趨于平衡，多糖溶出量緩慢，但浸提時間過長可能會致多糖鏈斷裂，結構發生變化，從而導致多糖的溶出量減少，或因為其他成分被提取出來影響了提取率。故選取1.5 h、2 h、2.5 h 3個水平進行正交優化分析。

圖2 不同提取時間對苦瓜籽粗多糖提取率的影響

2.3 料液比

從圖3可以看出，當料液比從1 ∶10增大到1 ∶30時，BMSP提取率呈上升趨勢；當料液比為1 ∶50時，達到最大值4.95%；繼續增大料液比，BMSP提取率基本保持平穩，上升幅度不明顯。考慮到各因素間相互作用的影響，選取 1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50共3個水平進行正交優化分析。

圖3 不同料液比對苦瓜籽粗多糖提取率的影響

2.4 提取次數

從圖4可以看出，隨著提取次數增加，BMSP的提取率先呈直線上升再趨于平緩，提取4次與3次的多糖提取率基本保持不變。這可能是在前3次的提取中，幾乎90%的多糖被提取出來，再增加提取次數，對多糖的提取率影響不大。除此之外，考慮到提取過程中消耗的成本和時間，故選取2、3、4次共3個水平進行正交優化分析。

圖4 不同提取次數對苦瓜籽粗多糖提取率的影響

2.5 正交實驗

在單因素實驗的基礎上，選定4因素3水平設計正交實驗。因素水平見表1。

表1 4因素3水平表

從正交實驗的極差(R)結果(表2)可知，各因素的影響順序為C

表2 正交實驗結果

表2的極差(R)和表3的偏差平方和的結果相一致，各因素的影響順序C

表3 正交實驗方差分析

2.6 驗證實驗

為了進一步驗證最優工藝的正確性和合理性，以理論上最優工藝提取苦瓜籽多糖，平行實驗3次，進行驗證實驗。結果，苦瓜籽多糖的平均提取率為5.65%，RSD=2.13%(n=3)。考慮到成本和后續濃縮等問題，結合極差和方差結果分析料液比對多糖的提取率的影響相對較小，故選取最小比例的料液比，此時提取率達5.61%。最終確定最佳工藝條件為提取溫度90 ℃，提取時間2.5 h，料液比1 ∶30，提取次數3次。

2.7 蛋白質含量

以牛血清白蛋白濃度為橫坐標，D(595 nm)值為縱坐標，繪制標準曲線如圖5所示，蛋白濃度與D值有較好的線性相關性，方程式為Y=0.030 9X+0.008 4，R2=0.999 9。最終求出BMSP中蛋白質含量為1.09%。

圖5 蛋白質濃度標準曲線

2.8 抗氧化活性

2.8.1 DPPH自由基清除率 從圖6可以看出，BMSP對DPPH自由基具有較強的清除能力，其中在3 mg/mL時，BMSP和維生素C的清除率相近，分別為81%和90%。

圖6 苦瓜籽粗多糖與維生素C對DPPH自由基的清除率

2.8.2 ·OH清除率 Fenton反應結果顯示，BMSP對鄰二氮菲-金屬鐵離子-H2O2體系產生的·OH具有清除作用，且隨著濃度的增加，清除能力逐漸增強，呈現良好劑量依賴性，最高能達到50%，相同濃度下的清除能力略低于維生素C。見圖7。

圖7 苦瓜籽粗多糖與維生素C對羥自由基的清除率

圖8 苦瓜籽粗多糖與維生素C對的清除作用

2.8.4 總還原能力 普魯士藍實驗結果顯示，BMSP具有較強的還原能力，且還原能力隨著多糖的濃度的增加而不斷增大；濃度從1 mg/mL增大到3 mg/mL，BMSP的還原能力緩慢增加，最高D值達0.65，但是與維生素C相比，還是相差很大。見圖9。

圖9 苦瓜籽粗多糖與維生素C的總還原能力比較

3 討論

本研究從藥食同源植物苦瓜的種仁苦瓜籽中提取多糖，在單因素實驗基礎上進行正交實驗設計，最終確定了多糖提取的最佳工藝，BMSP的提取率高達5.61%，為后續分離純化苦瓜籽多糖提供了基礎數據。因多糖在分離純化過程中損失量大，后期采用超聲或者微波等新型技術輔助提取以提高BMSP提取率。

本實驗采用4種體外抗氧化實驗方法，以自由基清除率為指標，分別評價BMSP和維生素C體外抗氧化活性。實驗表明，BMSP具有較強的抗氧化活性，隨著濃度的增大，當濃度增加到1 mg/mL后抗氧化活性的增強緩慢。用不同方法檢測BMSP抗氧化活性的結果具有一定差異，但BMSP對DPPH自由基和·OH清除能力，與強抗氧化劑維生素C相近，在天然抗氧化劑的研究開發方面具有潛在的應用價值。多糖的抗氧化活性與其結構中的半縮醛羥基數目、糖鏈結構及相對分子質量等有關[15]。對BMSP的進一步分離純化和構效關系的探討將有助于促進苦瓜籽藥材的開發和利用。