負載富血小板纖維蛋白的新型水凝膠對BMSCs體外成軟骨分化的影響

陳星光， 鄒承達， 宿廣昊， 張亞， 陸敏華， 王曉東

(蘇州大學附屬兒童醫院 1. 兒科臨床研究院， 2. 骨科 江蘇 蘇州 215025； 3. 蘇州市獨墅湖醫院骨科， 江蘇 蘇州 215025)

關節軟骨本身缺乏血管及神經，損傷后在缺乏外界干預的情況下可能加重關節磨損，繼發骨關節炎，嚴重影響患者的工作及生活[1]。因此，軟骨損傷修復一直是臨床研究中的熱點和難點[2]。近年來組織工程技術的發展為修復關節軟骨損傷帶來了新的曙光。殼聚糖/β-甘油磷酸鈉(β-glycerophosphate, β-GP)溫敏水凝膠是近年來軟骨修復的研究熱點。Chenite等[3]于2000年提出了殼聚糖/甘油磷酸鈉溫敏水凝膠體系。該水凝膠制備溫和，完全保持了殼聚糖本身的優點，且能向處于液態的混合液中加入藥物[4]、細胞因子甚至活的細胞，受到學者的高度關注。

富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin, PRF)是由法國學者Choukroun等[5]于2000年首先報道的第2代血小板濃縮物。PRF來源于自體，具有極高的生物安全性，現已被視為一種改善愈合和促進組織再生的新型自體來源生物材料[6]。前期研究[7]我們發現負載PRF的新型水凝膠理化性質良好，能夠緩釋包括胰島素樣生長因子1(IGF-1)、轉化生長因子β1(TGF-β1)在內的多種生長因子，并且具有良好的組織相容性。本次實驗將進一步研究負載PRF的新型水凝膠在體外對骨髓間充質干細胞(BMSCs)成軟骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

實驗動物及細胞：體重在0.5 kg左右的3～4周齡健康新西蘭大白兔，購自蘇州大學動物實驗中心[許可證號：SCXK(蘇)2013—0002]，實驗過程中對動物處置符合《實驗動物相關法規標準匯編2009年版》[8]；所用兔BMSCs由本實驗室自行分離、培養并經過鑒定[7, 9]。

試劑：相對分子質量為20萬的殼聚糖(中國國藥集團化學試劑有限公司)；β-GP(美國Sigma公司)；京尼平(上海源葉生物科技有限公司)；兔Ⅱ型膠原免疫組化試劑盒(英國Abcam公司)；DMEM/F12培養液(美國Hyclon公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；軟骨誘導液(DMEM/F12、10% 胎牛血清、6.25 mg/L胰島素、50 mg/L維生素C、10 μg/L TGF-β1)。

儀器：離心機、CO2細胞培養箱、酶標檢測儀(美國Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 殼聚糖溫敏水凝膠的制備

配制56%的β-GP水溶液，2%的殼聚糖醋酸溶液，0.1%的京尼平水溶液。向殼聚糖溶液中加入京尼平溶液，冰浴條件下，向殼聚糖/京尼平混合液中逐滴加入β-GP溶液，使殼聚糖、β-GP、0.1%京尼平三者體積比為6 ∶1 ∶1，邊滴加邊搖勻，靜置10 min后將混合液置入37 ℃恒溫水浴箱中，觀察并記錄其成膠時間。

1.3 PRF及其凍干粉末的制備

經兔耳緣靜脈抽取5 mL血液于15 mL離心管后立即離心(1 200 r/min，12 min)，可見血液分為3層結構(上層血清層、中層PRF層、下層紅細胞層)，倒去血清層，用鑷子夾出中間層，用無菌剪刀剪去殘余的紅細胞層，即可得主要呈白色凝膠狀的PRF；將PRF置于-80 ℃冰箱冷凍24 h，再置于真空冷凍干燥機中進行凍干(-88 ℃，0.011 kPa)，制得凍干PRF；用研缽將凍干PRF研磨成粉末，再加入0.5 mL培養液充分溶解，22 μm濾器過濾除菌，備用。

1.4 負載PRF的殼聚糖溫敏水凝膠的制備

向1.5 mL 2% 殼聚糖溶液中加入0.1%京尼平溶液0.25 mL后搖勻，加入過濾后的PRF溶液0.05 mL，再于冰浴條件下加入56% β-GP溶液0.25 mL，置于恒溫水浴箱中成膠。

1.5 FDA熒光染色法[10]觀察BMSCs在水凝膠表面的生長情況

將BMSCs接種于12孔板，每孔預先加入已成膠的負載PRF的新型殼聚糖水凝膠，恒溫箱培養；在第1、3、7 d棄培養液避光加入FDA熒光染色工作液(1 mL PBS中含有2 μL FDA染液)，熒光倒置顯微鏡觀察細胞生長并拍照。

1.6 兔BMSCs成軟骨誘導

將細胞分為負載PRF的新型水凝膠組(PRF組)、殼聚糖水凝膠組(殼聚糖組)以及單純誘導組(僅加入軟骨誘導液)。將細胞接種于24孔板中，2～3 d后換液，更換誘導液的同時加入相應支架材料，誘導2周后隨機選擇12孔加入低聚甲醛固定細胞并進行HE染色、番紅O-固綠染色、阿利新藍染色、兔Ⅱ型膠原免疫組化染色觀察軟骨分化情況。其余細胞誘導至第4周結束，誘導期間每2～3 d換液并收集上清液。

1.7 軟骨分化情況的染色觀察

1.7.1 HE染色 棄培養液，PBS洗1次，室溫干燥后加入蘇木素染15 min；水洗1次，加入分化液分化20～30 s，再加入自來水浸泡15 min或50 ℃左右溫水浸泡5 min后棄浸泡液；加入伊紅染液染1.5 min，水洗1次后，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.7.2 番紅O-固綠染色[11]待孔板內細胞自然干燥，用蘇木素染3 min；PBS漂洗1次，1%鹽酸乙醇分化(1 mL鹽酸+99 mL 75%乙醇)；水洗1次，0.2%固綠染5 min；水洗1次，0.1%番紅O染液染1～2 min；水洗1次，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.7.3 阿利新藍染色[12]將97 mL蒸餾水、3 mL冰醋酸和1 g阿利新藍混勻制成染液，取適量染液均勻加入孔板中，過夜。次日棄去染液，PBS漂洗1次，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.7.4 兔Ⅱ型膠原免疫組化染色 向孔板中加入過氧化氫阻斷液，孵育10 min；PBS洗3次，加入鼠抗兔IgG(一抗)，4 ℃孵育過夜；PBS洗3次，加入生物素化的羊抗鼠IgG(二抗)，室溫孵育10 min；PBS洗3次，加入鏈霉素過氧化物酶，室溫孵育10 min；PBS洗3次。向1 mL DAB底物中加入20 μL DAB顯色劑，混勻后加入孔板中，孵育10 min；PBS洗3次后倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 阿利新藍比色法[13]檢測上清液中糖胺聚糖含量

配制40、20、10 μg/mL的硫酸軟骨素標準品溶液，取標準品和上清液各100 μL加入1.5 mL EP管中，再分別加入8 mol/L 鹽酸胍50 μL，搖勻后加入50 μL試劑1(0.75% Triton X-100，3% H2SO4)，搖勻后靜置15 min；再加入650 μL低溫試劑2(將試劑1用蒸餾水稀釋3倍)后過夜；過夜后的溶液離心(12 000×g，15 min)，取740 μL上清液至新EP管中；加入500 μL阿利新藍染液(0.08% 阿利新藍，0.25% Triton X-100，0.5 mol/L鹽酸胍)，搖勻后靜置6 h以上；離心(12 000×g，15 min)后棄上清液，加入750 μL DMSO洗液(40% DMSO，0.03 mol/L MgCl2)，振蕩半小時后離心(12 000×g，15 min)，再棄上清液，重復操作1次；加入500 μL分散液(4 mol/L鹽酸胍，33%正丙醇)，振蕩15 min后加入96孔板中(每孔240 μL)，在600 nm波長下用酶標儀測定光密度(D)值；根據標準品D值求出標準曲線方程，各樣品檢測3次，結果取平均值，根據標準曲線得出該樣品上清液中糖胺聚糖含量。

1.9 ELISA競爭法檢測上清液中Ⅱ型膠原含量

分別將上清液或不同濃度標準品(100 μL/孔)加入相應孔中，用封板膠封住反應孔，室溫孵育120 min；洗板5次，在吸水紙上拍干，加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔)，用封板膠封住反應孔，室溫孵育60 min；洗板5次，拍干，加入酶結合物工作液100 μL/孔，封板膠封住反應孔，避光室溫孵育20 min；洗板5次，拍干，加入顯色劑TMB 100 μL/孔，避光室溫孵育20 min；加入終止液50 μL/孔，混勻后立即測D(450 nm)值。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 水凝膠外觀

含有京尼平的混合液在37 ℃下約8 min形成藍色不透明的水凝膠，其機械強度較好，能夠被切割塑形。見圖1。

圖1 含有京尼平的殼聚糖溫敏水凝膠外觀

2.2 BMSCs在水凝膠表面的生長情況

按預定時間進行FDA染色，在熒光倒置顯微鏡下可看到BMSCs在凝膠表明的生長狀況。由于FDA可在活細胞內被脂酶分解成能自由透過細胞膜的產生綠熒光的熒光素，故可觀察細胞活性。由圖2可見，FDA染色效果滿意，細胞形態好，表明細胞活性較好；同時細胞能夠在水凝膠表面以較高的速率增殖。

圖2 殼聚糖水凝膠表面BMSCs的生長情況(熒光倒置顯微鏡×40)

2.3 軟骨分化染色結果

2.3.1 HE染色結果 PRF組中出現大量多個核細胞，部分細胞的核融合成較大的細胞核，細胞周圍染色清晰，界限清楚，可見細胞大體呈均勻一致的多邊形結構，長梭狀的細胞較少，間或夾雜于類軟骨樣細胞中，較難辨別。殼聚糖組和單純誘導組亦可見多個核細胞，但數量較PRF組少，多個核細胞周圍染色清晰，界限清楚，細胞大體呈多邊形結構，但可見大量未分化的呈長梭形的細胞。見圖3。

2.3.2 番紅O-固綠染色結果 PRF組中大量細胞被成功染色，且染色程度深，說明細胞周圍分泌大量糖胺聚糖；殼聚糖組和單純誘導組已染色部分顏色較淺，甚至有部分細胞脫色，說明細胞所分泌糖胺聚糖含量較少，此外，殼聚糖組、單純誘導組中亦可見大量未能染色區域。見圖4。

圖3 成軟骨誘導2周后各組細胞HE染色情況(×100)

圖4 成軟骨誘導2周后各組細胞番紅O-固綠染色(×100)

2.3.3 阿利新藍染色結果 PRF組中大量細胞被成功染色，染色程度深且均勻，說明細胞周圍分泌大量糖胺聚糖；殼聚糖組和單純誘導組中可見部分細胞未能成功染色，已染色部分顏色較淺且不均勻，部分區域無明顯細胞結構，考慮可能為其他細胞外基質殘留成分所導致的染色。阿利新藍染色結果與番紅O-固綠染色結果較為一致。見圖5。

圖5 成軟骨誘導2周后各組細胞阿利新藍染色(×200)

2.3.4 兔Ⅱ型膠原免疫組化染色結果 3組中均有大量Ⅱ型膠原被成功染色。相比較而言，PRF組染色程度深且均勻，說明細胞周圍分泌了大量的Ⅱ型膠原；殼聚糖組和單純誘導組染色情況亦較為滿意，但染色程度較PRF組淺且不均勻，部分區域仍可見梭形細胞，考慮為BMSCs或成纖維細胞。見圖6。

圖6 成軟骨誘導2周后各組細胞Ⅱ型膠原免疫組化染色(×100)

2.4 上清液中糖胺聚糖含量

硫酸軟骨素標準品的標準曲線方程為Y=0.001 2X+0.049 5 ，該方程與標準曲線擬合度高(R2=0.999)。根據D值求得各組細胞分泌糖胺聚糖結果見圖7，可見在4周內，PRF組分泌糖胺聚糖的能力均高于殼聚糖組與單純誘導組，差異有統計學意義(P<0.05)，殼聚糖組與單純誘導組間差異無統計學意義(P>0.05)。

圖7 3組細胞培養上清液中糖胺聚糖的含量(n=5)

2.5 上清液中Ⅱ型膠原含量

試劑盒標準品的標準曲線方程為Y=0.101 9X+0.103，該方程與標準曲線擬合度高(R2=0.957 27)。根據D值求得各組細胞分泌Ⅱ型膠原結果如圖8。在4周內，PRF組分泌Ⅱ型膠原的能力均高于殼聚糖組與單純誘導組，差異有統計學意義(P<0.05)，殼聚糖組與單純誘導組間差異無統計學意義(P>0.05)。

圖8 3組細胞培養上清液中Ⅱ型膠原的含量(n=5)

3 討論

軟骨損傷修復在骨科仍是一大難題，目前國內外研究雖多，但尚無滿意的治療手段[14]。隨著組織工程技術的進步與發展，軟骨組織工程技術修復關節軟骨缺損成為具有廣闊前景的技術手段之一[15-16]。

殼聚糖分子式類似于軟骨細胞外基質中的糖胺聚糖，因而在軟骨組織工程領域受到了廣泛的關注[17]?；跉ぞ厶堑臏孛籼匦?，結合外科的微創理念，有學者提出可在臨床中采用注射的方法進行關節軟骨損傷的修復。目前所制備的殼聚糖/甘油磷酸鈉溫敏水凝膠強度較低，采用戊二醛進行交聯可以增加強度，但由于戊二醛細胞相容性差，修復效果并不十分令人滿意。京尼平相較于甲醛、戊二醛、二異氰酸鹽等化學交聯劑的細胞毒性大大減小，具有良好的細胞相容性[18]，被作為一種天然的生物交聯劑而得到了廣泛應用[19]。采用京尼平作為交聯劑能夠有效增加殼聚糖溫敏水凝膠的強度，并且基本沒有細胞毒性。

PRF是在不添加抗凝劑的情況下，離心外周血而制備的一種血液制品，PRF中含有TGF-β1、IGF-1、VEGF等生長因子。制備原理是通過離心使血液中不同沉降系數及浮力密度的成分分層，與富血小板血漿的制備相比，該方法極大地簡化了操作，更適合臨床應用。我們在研究中采用1 200 r/min離心12 min制備PRF，結果令人滿意。

我們的課題充分考慮臨床應用，通過京尼平增加殼聚糖分子鏈內部交聯強度，再向其中加入甘油磷酸鈉，借助混合液的溫敏特性制備一種在常溫下保持液態、在體溫下能盡快凝膠且具有一定力學強度的可注射溫敏水凝膠。在前期實驗[7]中，我們已經證明了殼聚糖/β-GP/京尼平溫敏水凝膠強度較殼聚糖/β-GP溫敏水凝膠強，能夠在一定程度上切割塑形；負載PRF的新型水凝膠也能夠緩釋IGF-1、TGF-β1等生長因子。有研究表明[20]添加外源性TGF-β1和IGF-1可在體外促進脂肪來源干細胞成軟骨分化，TGF-β1的誘導效果強于IGF-1，并且同時使用兩種生長因子時還具有協同作用。

蛋白多糖及膠原是軟骨基質的主要成分，而糖胺聚糖和Ⅱ型膠原則是關節軟骨所特有的細胞外基質成分，在調節軟骨功能及維持細胞表型方面具有重要作用。在進行BMSCs成軟骨誘導后的糖胺聚糖和Ⅱ型膠原定量檢測中，負載PRF的新型水凝膠與僅含有殼聚糖水凝膠或單純誘導者相比均具有明顯優勢。說明殼聚糖本身并無促進BMSCs成軟骨分化的作用，而PRF中所含有的多種生長因子在成軟骨誘導液的參與下，具有一定的促進BMSCs成軟骨分化的作用。成軟骨誘導染色時，PRF組HE染色可見大量的多個核細胞，但殼聚糖組與單純誘導組內仍有大量的未能夠成功誘導的長梭形細胞；番紅O-固綠和阿利新藍染色以及Ⅱ型膠原免疫組化染色則分別證實了細胞外基質內含有大量糖胺聚糖及Ⅱ型膠原。

綜上，本研究所制備的負載PRF的新型溫敏水凝膠細胞相容性較好，兔BMSCs能夠在其表面生長、增殖；該水凝膠能夠在一定程度上促進BMSCs成軟骨分化，具有修復關節軟骨缺損的應用前景。